CAJ | 학술논문

本研究利用酵母表达系统制备纤维连接蛋白(fibronectin,FN)N端肝素结合域多肽,检测多肽的生物学活性,进行多肽治疗DIC大鼠的实验研究.利用PCR技术从FNcDNA中扩增FN N端肝素结合域序列,将获得的目的基因片段克隆至T载体,筛选后转移至酵母表达pAo815SM载体进行选择,再构建重组酵母表达pPIC9K载体,线性化重组载体并转染GS115酵母细胞,在GS115酵母细胞表达目的多肽.发酵液经80%硫酸胺沉淀,沉淀物过S100柱分离纯化,纯化物再经过SP柱纯化,测定多肽结合肝素等生物学活性.股静脉注射内毒素脂多糖(LPS)50mg/kg建立大鼠DIC模型.建立的DIC SD大鼠40只,随机分2组,每组20只,一组为rhFNHN-29多肽治疗组,另一组为生理盐水对照组.治疗组分别于注射LPS前半小时、注射后2小时、4小时尾静脉注射rhFNHN-29多肽(10mg/kg);生理盐水对照组注射等体积生理盐水.另设正常对照组SD大鼠20只,注射等体积生理盐水作为正常对照组.各组大鼠于股静脉注射LPS后6小时,对侧股静脉抽血测血常规,分离血浆检测血浆TNFa和凝血象.于注射LPS后72小时处死大鼠,取肝、肾、脾、肺、心、脑组织进行病理组织学检查.结果表明:成功地在酵母表达系中表达了目的多肽,其表达量达到30 mg/L,所表达的多肽具有结合肝素活性.在多肽抗DIC作用的动物实验中发现多肽治疗组的血浆TNFa水平、血常规指标、凝血象和病理组织学的改变都较生理盐水对照组更接近正常对照组.结论:成功地制备了rhFNHN-29多肽,这种多肽能在一定程度上预防和治疗DIC.
본연구이용효모표체계통제비섬유련접단백(fibronectin,FN)N단간소결합역다태,검측다태적생물학활성,진행다태치료DIC대서적실험연구.이용PCR기술종FNcDNA중확증FN N단간소결합역서렬,장획득적목적기인편단극륭지T재체,사선후전이지효모표체pAo815SM재체진행선택,재구건중조효모표체pPIC9K재체,선성화중조재체병전염GS115효모세포,재GS115효모세포표체목적다태.발효액경80%류산알침정,침정물과S100주분리순화,순화물재경과SP주순화,측정다태결합간소등생물학활성.고정맥주사내독소지다당(LPS)50mg/kg건립대서DIC모형.건립적DIC SD대서40지,수궤분2조,매조20지,일조위rhFNHN-29다태치료조,령일조위생리염수대조조.치료조분별우주사LPS전반소시、주사후2소시、4소시미정맥주사rhFNHN-29다태(10mg/kg);생리염수대조조주사등체적생리염수.령설정상대조조SD대서20지,주사등체적생리염수작위정상대조조.각조대서우고정맥주사LPS후6소시,대측고정맥추혈측혈상규,분리혈장검측혈장TNFa화응혈상.우주사LPS후72소시처사대서,취간、신、비、폐、심、뇌조직진행병리조직학검사.결과표명:성공지재효모표체계중표체료목적다태,기표체량체도30 mg/L,소표체적다태구유결합간소활성.재다태항DIC작용적동물실험중발현다태치료조적혈장TNFa수평、혈상규지표、응혈상화병리조직학적개변도교생리염수대조조경접근정상대조조.결론:성공지제비료rhFNHN-29다태,저충다태능재일정정도상예방화치료DIC.