CAJ | 학술논문

PCR扩增突变的5'-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5'-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase,EPSPS) cDNA全长序列,插入pLitmus28得到pLEPSPS,进而通过反向PCR在EPSPS 235/236 aa之间将其打断为无功能的片段.选用人工构建的具有顺式和反式剪接功能的mini型蛋白内含子Ssp DnaB和Rma DnaB,插入被打断的aroA(抗除草剂基因),构建了质粒 pLEBC、pLEBT、pLERC和pLERT.将4种重组质粒中的aroA-In(蛋白内含子Intein插入aroA)融合基因插入pET-32得到表达载体pETLEBC、pETLEBT、pETLERC 和pETLERT,IPTG诱导后,SDS-PAGE分析显示其能在DE3中有效表达并发生相应的蛋白剪接.将aroA-cis Ssp DnaB 和 aroA -cis Rma DnaB融合基因分别插入pLYM中进一步构建成植物表达载体,农杆菌叶盘法转化烟草.基因组PCR分析表明融合基因整合入植物核基因组;RT-PCR分析显示其可在高等植物细胞中成功表达.结果说明蛋白内含子基因可以转化高等真核细胞,蛋白剪接技术可应用于高等植物细胞,从而为防止植物转基因扩散提供了一条新的途径.
PCR확증돌변적5'-희순병동산망초산-3-린산합성매(5'-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthetase,EPSPS) cDNA전장서렬,삽입pLitmus28득도pLEPSPS,진이통과반향PCR재EPSPS 235/236 aa지간장기타단위무공능적편단.선용인공구건적구유순식화반식전접공능적mini형단백내함자Ssp DnaB화Rma DnaB,삽입피타단적aroA(항제초제기인),구건료질립 pLEBC、pLEBT、pLERC화pLERT.장4충중조질립중적aroA-In(단백내함자Intein삽입aroA)융합기인삽입pET-32득도표체재체pETLEBC、pETLEBT、pETLERC 화pETLERT,IPTG유도후,SDS-PAGE분석현시기능재DE3중유효표체병발생상응적단백전접.장aroA-cis Ssp DnaB 화 aroA -cis Rma DnaB융합기인분별삽입pLYM중진일보구건성식물표체재체,농간균협반법전화연초.기인조PCR분석표명융합기인정합입식물핵기인조;RT-PCR분석현시기가재고등식물세포중성공표체.결과설명단백내함자기인가이전화고등진핵세포,단백전접기술가응용우고등식물세포,종이위방지식물전기인확산제공료일조신적도경.