微生物学报
微生物學報
미생물학보
ACTA MICROBIOLOGICA SINICA
2000年
6期
579-585
,共7页
马忠华%罗如新%夏怡丰%王文东%陈文峻%蒯本科
馬忠華%囉如新%夏怡豐%王文東%陳文峻%蒯本科
마충화%라여신%하이봉%왕문동%진문준%괴본과
邻单胞菌邻苯二酚1%2-双加氧酶基因(tfd C)%PCR%克隆%表达
鄰單胞菌鄰苯二酚1%2-雙加氧酶基因(tfd C)%PCR%剋隆%錶達
린단포균린분이분1%2-쌍가양매기인(tfd C)%PCR%극륭%표체
根据已报道的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因(tfdC)序列,设计PCR引物,从一株邻单胞菌(Plesiomonas)的pL1质粒上扩增到tfdC基因片段,连接到pGEM-T载体上,并转化大肠杆菌JM109菌株,筛选到阳性克隆.序列分析结果表明,PCR产物全长801bp,有一个阅读框,编码255个氨基酸,与增氧产碱菌(Alcaligeneseutroplus)的tfdC基因相比,在693位相差一个碱基(C→A),导致编码产物在228位相差一个氨基酸.将目的片段克隆到pBluescrip-tIIKS质粒载体上,筛选到阳性克隆pBt12G,在大肠杆菌JM109中可表达邻苯二酚1,2-双加氧酶(C120)的活性;将翻译起始密码子为ATG的目的片段克隆到pET-30a质粒载体上,筛选到阳性克隆pET30A,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中可表达目的蛋白.C120是芳香族化合物降解过程中的关键酶,为了进一步在草坪草中表达tfdC基因,利用草坪草降解环境中芳香族污染物,将该基因翻译起始密码子由GTG突变成ATG,突变后的基因在大肠杆菌中可正常表达C120的活性.
根據已報道的鄰苯二酚1,2-雙加氧酶基因(tfdC)序列,設計PCR引物,從一株鄰單胞菌(Plesiomonas)的pL1質粒上擴增到tfdC基因片段,連接到pGEM-T載體上,併轉化大腸桿菌JM109菌株,篩選到暘性剋隆.序列分析結果錶明,PCR產物全長801bp,有一箇閱讀框,編碼255箇氨基痠,與增氧產堿菌(Alcaligeneseutroplus)的tfdC基因相比,在693位相差一箇堿基(C→A),導緻編碼產物在228位相差一箇氨基痠.將目的片段剋隆到pBluescrip-tIIKS質粒載體上,篩選到暘性剋隆pBt12G,在大腸桿菌JM109中可錶達鄰苯二酚1,2-雙加氧酶(C120)的活性;將翻譯起始密碼子為ATG的目的片段剋隆到pET-30a質粒載體上,篩選到暘性剋隆pET30A,在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中可錶達目的蛋白.C120是芳香族化閤物降解過程中的關鍵酶,為瞭進一步在草坪草中錶達tfdC基因,利用草坪草降解環境中芳香族汙染物,將該基因翻譯起始密碼子由GTG突變成ATG,突變後的基因在大腸桿菌中可正常錶達C120的活性.
근거이보도적린분이분1,2-쌍가양매기인(tfdC)서렬,설계PCR인물,종일주린단포균(Plesiomonas)적pL1질립상확증도tfdC기인편단,련접도pGEM-T재체상,병전화대장간균JM109균주,사선도양성극륭.서렬분석결과표명,PCR산물전장801bp,유일개열독광,편마255개안기산,여증양산감균(Alcaligeneseutroplus)적tfdC기인상비,재693위상차일개감기(C→A),도치편마산물재228위상차일개안기산.장목적편단극륭도pBluescrip-tIIKS질립재체상,사선도양성극륭pBt12G,재대장간균JM109중가표체린분이분1,2-쌍가양매(C120)적활성;장번역기시밀마자위ATG적목적편단극륭도pET-30a질립재체상,사선도양성극륭pET30A,재대장간균BL21(DE3)plysS중가표체목적단백.C120시방향족화합물강해과정중적관건매,위료진일보재초평초중표체tfdC기인,이용초평초강해배경중방향족오염물,장해기인번역기시밀마자유GTG돌변성ATG,돌변후적기인재대장간균중가정상표체C120적활성.
