河北联合大学学报(医学版)
河北聯閤大學學報(醫學版)
하북연합대학학보(의학판)
JOURNAL OF NORTH CHINA COAL MEDICAL UNIVERSITY
2012年
1期
4-6
,共3页
刘智群%王梅梅%侯灵彤%张放%熊亚南%刘敏%李淑英
劉智群%王梅梅%侯靈彤%張放%熊亞南%劉敏%李淑英
류지군%왕매매%후령동%장방%웅아남%류민%리숙영
EB病毒%BARF1基因%真核表达载体
EB病毒%BARF1基因%真覈錶達載體
EB병독%BARF1기인%진핵표체재체
①目的 构建携带EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)编码BARF1基因的真核表达载体.②方法 根据GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,设计特异性引物,并在两端添加酶切位点;常规培养B95-8细胞,提取细胞RNA,通过RT-PCR扩增BARF1基因,将其克隆到pUM-T载体,转化E.coli DH5α,经氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切与测序鉴定,证实BARF1基因已克隆到pUM-T载体.凝胶回收双酶切产物BARF1片段,再将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)-his,转化E.coli DH5α,通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,提取质粒并用EcoRI和XbaI双酶切分析,确认插入方向.③结果 以B95-8细胞提取RNA进行RT-PCR扩增的cDNA为模板扩增BARF1,得到与预期片段大小相符的666bp的片段;对所提质粒进行鉴定后,证实目的 基因BARF1片段已插入pUM-T载体,经双酶切和测序分析,确认BARF1基因已正确连接到pcDNA3.1(+)-his真核表达载体.④结论 成功地构建真核表达载体.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.
①目的 構建攜帶EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)編碼BARF1基因的真覈錶達載體.②方法 根據GenBan提供的BARF1基因的cDNA序列,設計特異性引物,併在兩耑添加酶切位點;常規培養B95-8細胞,提取細胞RNA,通過RT-PCR擴增BARF1基因,將其剋隆到pUM-T載體,轉化E.coli DH5α,經氨芐青黴素抗性篩選暘性剋隆,提取質粒併用EcoRI和XbaI雙酶切與測序鑒定,證實BARF1基因已剋隆到pUM-T載體.凝膠迴收雙酶切產物BARF1片段,再將其連接到真覈錶達載體pcDNA3.1(+)-his,轉化E.coli DH5α,通過氨芐青黴素抗性篩選暘性剋隆,提取質粒併用EcoRI和XbaI雙酶切分析,確認插入方嚮.③結果 以B95-8細胞提取RNA進行RT-PCR擴增的cDNA為模闆擴增BARF1,得到與預期片段大小相符的666bp的片段;對所提質粒進行鑒定後,證實目的 基因BARF1片段已插入pUM-T載體,經雙酶切和測序分析,確認BARF1基因已正確連接到pcDNA3.1(+)-his真覈錶達載體.④結論 成功地構建真覈錶達載體.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.
①목적 구건휴대EB병독(Epstein-Barr virus,EBV)편마BARF1기인적진핵표체재체.②방법 근거GenBan제공적BARF1기인적cDNA서렬,설계특이성인물,병재량단첨가매절위점;상규배양B95-8세포,제취세포RNA,통과RT-PCR확증BARF1기인,장기극륭도pUM-T재체,전화E.coli DH5α,경안변청매소항성사선양성극륭,제취질립병용EcoRI화XbaI쌍매절여측서감정,증실BARF1기인이극륭도pUM-T재체.응효회수쌍매절산물BARF1편단,재장기련접도진핵표체재체pcDNA3.1(+)-his,전화E.coli DH5α,통과안변청매소항성사선양성극륭,제취질립병용EcoRI화XbaI쌍매절분석,학인삽입방향.③결과 이B95-8세포제취RNA진행RT-PCR확증적cDNA위모판확증BARF1,득도여예기편단대소상부적666bp적편단;대소제질립진행감정후,증실목적 기인BARF1편단이삽입pUM-T재체,경쌍매절화측서분석,학인BARF1기인이정학련접도pcDNA3.1(+)-his진핵표체재체.④결론 성공지구건진핵표체재체.pcDNA3.1(+)/BARF1-his.
