CAJ | 학술논문

目的应用转基因技术体外培养稳定表达人内皮抑素的视网膜色素上皮(RPE)细胞,为脉络膜新生血管(CNV)基因治疗奠定基础.方法采用人内皮抑素真核表达载体pSecTagA-h内皮抑素,应用电转移法及脂质体介导法转染Brown Norway(BN)大鼠RPE细胞,以平阳霉素筛选出表达内皮抑素的RPE细胞,传代培养3周.转染后提取RPE细胞总DNA,聚合酶链反应(PCR)产物琼脂糖凝胶电泳,原位杂交,蛋白印记和免疫组织化学观察内皮抑素在转染RPE细胞中的表达情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染RPE细胞培养上清液中内皮抑素的表达水平;四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)测定所表达内皮抑素蛋白活性.结果 PCR检测结果表明转染后的RPE细胞总DNA中存在长度为550碱基对左右的特异性条带;原位杂交,免疫组织化学观察到大量RPE细胞表达内皮抑素mRNA及内皮抑素蛋白;蛋白印记显示,RPE细胞裂解产物中有内皮抑素阳性条带;ELISA法检测到转染后3、5、7、10、14、20 d6个时间点培养上清液内皮抑素蛋白表达量分别为(321.5±41.0)、(162.5±23.45)、(78±11.22)、(78±9.87)、(78±10.06)、(78±12.67)ng/ml;MTT显示,培养上清液中内皮抑素能够抑制脐静脉内皮细胞304的增生,IC50为45.68 μg/ml,对RPE细胞、K562的生长无影响.结论经电转移法及脂质体介导转染法获得体外培养稳定表达内皮抑素的RPE细胞是可行的,转染成功的RPE细胞能够稳定表达内皮抑素蛋白,所表达的内皮抑素蛋白具有生物活性.
목적 응용전기인기술체외배양은정표체인내피억소적시망막색소상피(RPE)세포,위맥락막신생혈관(CNV)기인치료전정기출.방법 채용인내피억소진핵표체재체pSecTagA-h내피억소,응용전전이법급지질체개도법전염Brown Norway(BN)대서RPE세포,이평양매소사선출표체내피억소적RPE세포,전대배양3주.전염후제취RPE세포총DNA,취합매련반응(PCR)산물경지당응효전영,원위잡교,단백인기화면역조직화학관찰내피억소재전염RPE세포중적표체정황;매련면역흡부시험(ELISA)검측전염RPE세포배양상청액중내피억소적표체수평;사갑기우담서람비색법(MTT)측정소표체내피억소단백활성.결과 PCR검측결과표명전염후적RPE세포총DNA중존재장도위550감기대좌우적특이성조대;원위잡교,면역조직화학관찰도대량RPE세포표체내피억소mRNA급내피억소단백;단백인기현시,RPE세포렬해산물중유내피억소양성조대;ELISA법검측도전염후3、5、7、10、14、20 d6개시간점배양상청액내피억소단백표체량분별위(321.5±41.0)、(162.5±23.45)、(78±11.22)、(78±9.87)、(78±10.06)、(78±12.67)ng/ml;MTT현시,배양상청액중내피억소능구억제제정맥내피세포304적증생,IC50위45.68 μg/ml,대RPE세포、K562적생장무영향.결론 경전전이법급지질체개도전염법획득체외배양은정표체내피억소적RPE세포시가행적,전염성공적RPE세포능구은정표체내피억소단백,소표체적내피억소단백구유생물활성.