山西医药杂志
山西醫藥雜誌
산서의약잡지
SHANXI MEDICAL JOURNAL
2012年
11期
1080-1083
,共4页
RNA干扰%慢病毒属%Nogo受体
RNA榦擾%慢病毒屬%Nogo受體
RNA간우%만병독속%Nogo수체
目的 构建靶向大鼠Nogo受体(NgR)的小发夹RNA(shRNA)慢病毒载体并进行病毒颗粒包装及滴度测定.方法 设计合成3对针对大鼠NgR及1对非特异性的寡核苷酸单链,退火后得到shNgR双链,克隆入慢病毒载体pGC-LV,行聚合酶链反应(PCR)并测序鉴定重组体;构建NgR过表达载体,双酶切并测序鉴定插入序列正确性;NgR过表达载体和各慢病毒shRNA干扰载体共转染293T细胞后,定量反转录(RT)-PCR及蛋白印迹法筛选有效的慢病毒shRNA干扰载体;重组NgR慢病毒shRNA干扰载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,包装并收集病毒颗粒,进行病毒浓缩液滴度检测.结果 PCR及DNA测序结果均显示慢病毒载体pGC-LV-shNgR构建正确;双酶切及测序亦显示NgR过表达载体插入序列正确;定量RT-PCR及蛋白印迹法结果表明所构建的3个慢病毒载体pGC-LV-shNgR均可以有效干扰NgR的表达,其中pGC-LV-shNgR-A干扰效率最高;包装病毒颗粒后,检测病毒浓缩液的滴度为2×107 TU/mL.结论 成功构建靶向大鼠Nogo受体的shRNA慢病毒载体并进行病毒颗粒包装,浓缩的病毒液可以用于后续研究.
目的 構建靶嚮大鼠Nogo受體(NgR)的小髮夾RNA(shRNA)慢病毒載體併進行病毒顆粒包裝及滴度測定.方法 設計閤成3對針對大鼠NgR及1對非特異性的寡覈苷痠單鏈,退火後得到shNgR雙鏈,剋隆入慢病毒載體pGC-LV,行聚閤酶鏈反應(PCR)併測序鑒定重組體;構建NgR過錶達載體,雙酶切併測序鑒定插入序列正確性;NgR過錶達載體和各慢病毒shRNA榦擾載體共轉染293T細胞後,定量反轉錄(RT)-PCR及蛋白印跡法篩選有效的慢病毒shRNA榦擾載體;重組NgR慢病毒shRNA榦擾載體和病毒包裝質粒共轉染293T細胞,包裝併收集病毒顆粒,進行病毒濃縮液滴度檢測.結果 PCR及DNA測序結果均顯示慢病毒載體pGC-LV-shNgR構建正確;雙酶切及測序亦顯示NgR過錶達載體插入序列正確;定量RT-PCR及蛋白印跡法結果錶明所構建的3箇慢病毒載體pGC-LV-shNgR均可以有效榦擾NgR的錶達,其中pGC-LV-shNgR-A榦擾效率最高;包裝病毒顆粒後,檢測病毒濃縮液的滴度為2×107 TU/mL.結論 成功構建靶嚮大鼠Nogo受體的shRNA慢病毒載體併進行病毒顆粒包裝,濃縮的病毒液可以用于後續研究.
목적 구건파향대서Nogo수체(NgR)적소발협RNA(shRNA)만병독재체병진행병독과립포장급적도측정.방법 설계합성3대침대대서NgR급1대비특이성적과핵감산단련,퇴화후득도shNgR쌍련,극륭입만병독재체pGC-LV,행취합매련반응(PCR)병측서감정중조체;구건NgR과표체재체,쌍매절병측서감정삽입서렬정학성;NgR과표체재체화각만병독shRNA간우재체공전염293T세포후,정량반전록(RT)-PCR급단백인적법사선유효적만병독shRNA간우재체;중조NgR만병독shRNA간우재체화병독포장질립공전염293T세포,포장병수집병독과립,진행병독농축액적도검측.결과 PCR급DNA측서결과균현시만병독재체pGC-LV-shNgR구건정학;쌍매절급측서역현시NgR과표체재체삽입서렬정학;정량RT-PCR급단백인적법결과표명소구건적3개만병독재체pGC-LV-shNgR균가이유효간우NgR적표체,기중pGC-LV-shNgR-A간우효솔최고;포장병독과립후,검측병독농축액적적도위2×107 TU/mL.결론 성공구건파향대서Nogo수체적shRNA만병독재체병진행병독과립포장,농축적병독액가이용우후속연구.
