解剖学杂志
解剖學雜誌
해부학잡지
CHINESE JOURNAL OF ANATOMY
2012年
1期
82-85,108
,共5页
欧阳长杰%滕大才%曲德伟%王德广%徐铁军
歐暘長傑%滕大纔%麯德偉%王德廣%徐鐵軍
구양장걸%등대재%곡덕위%왕덕엄%서철군
脑源性神经营养因子基因%重组质粒%基因表达%COS-7细胞
腦源性神經營養因子基因%重組質粒%基因錶達%COS-7細胞
뇌원성신경영양인자기인%중조질립%기인표체%COS-7세포
目的:构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因真核表达载体,检测其转染COS-7细胞后的表达.方法:从大鼠海马组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得目的基因片段,克隆至pGEM-T载体中.经测序确证后将BDNFcDNA片段与pEGFP-N1载体定向连接.将鉴定正确的重组体pEGFP-N1-BDNF以脂质体法转染至COS-7细胞中,用RT-PCR鉴定BDNF mRNA的表达,免疫印迹法检测BDNF蛋白质表达水平.结果:克隆了BDNF的cDNA,并构建了其真核表达载体pEGFP-N1-BDNF,经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；免疫印迹法分析显示,转染48 h时,COS-7细胞以分泌proBDNF-GFP融合蛋白为主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融合蛋白为主.结论:成功构建pEGFP-N1-BDNF真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到高效表达,BDNF前体及成熟体同时分泌到胞外,在不同时间点分泌组合不同.
目的:構建腦源性神經營養因子(BDNF)基因真覈錶達載體,檢測其轉染COS-7細胞後的錶達.方法:從大鼠海馬組織中提取總RNA,採用RT-PCR方法穫得目的基因片段,剋隆至pGEM-T載體中.經測序確證後將BDNFcDNA片段與pEGFP-N1載體定嚮連接.將鑒定正確的重組體pEGFP-N1-BDNF以脂質體法轉染至COS-7細胞中,用RT-PCR鑒定BDNF mRNA的錶達,免疫印跡法檢測BDNF蛋白質錶達水平.結果:剋隆瞭BDNF的cDNA,併構建瞭其真覈錶達載體pEGFP-N1-BDNF,經限製性內切酶酶切鑒定及測序分析證實瞭其序列的正確性；免疫印跡法分析顯示,轉染48 h時,COS-7細胞以分泌proBDNF-GFP融閤蛋白為主,在96 h以分泌成熟BDNF-GFP融閤蛋白為主.結論:成功構建pEGFP-N1-BDNF真覈錶達載體,併且在COS-7細胞中得到高效錶達,BDNF前體及成熟體同時分泌到胞外,在不同時間點分泌組閤不同.
목적:구건뇌원성신경영양인자(BDNF)기인진핵표체재체,검측기전염COS-7세포후적표체.방법:종대서해마조직중제취총RNA,채용RT-PCR방법획득목적기인편단,극륭지pGEM-T재체중.경측서학증후장BDNFcDNA편단여pEGFP-N1재체정향련접.장감정정학적중조체pEGFP-N1-BDNF이지질체법전염지COS-7세포중,용RT-PCR감정BDNF mRNA적표체,면역인적법검측BDNF단백질표체수평.결과:극륭료BDNF적cDNA,병구건료기진핵표체재체pEGFP-N1-BDNF,경한제성내절매매절감정급측서분석증실료기서렬적정학성；면역인적법분석현시,전염48 h시,COS-7세포이분비proBDNF-GFP융합단백위주,재96 h이분비성숙BDNF-GFP융합단백위주.결론:성공구건pEGFP-N1-BDNF진핵표체재체,병차재COS-7세포중득도고효표체,BDNF전체급성숙체동시분비도포외,재불동시간점분비조합불동.
