中华微生物学和免疫学杂志
中華微生物學和免疫學雜誌
중화미생물학화면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
2005年
8期
614-619
,共6页
卞继峰%于修平%耿昭%卢翌%穆玉兰%胡海燕%刘浩
卞繼峰%于脩平%耿昭%盧翌%穆玉蘭%鬍海燕%劉浩
변계봉%우수평%경소%로익%목옥란%호해연%류호
胞内寄生菌%基因免疫%启动子%硝酸盐还原酶基因
胞內寄生菌%基因免疫%啟動子%硝痠鹽還原酶基因
포내기생균%기인면역%계동자%초산염환원매기인
目的构建一种新型双启动子表达载体pCMVnir,研究其与胞内寄生菌联合应用促进基因免疫效果的作用. 方法细菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB为厌氧诱导启动子,根据nirB启动子的结构,设计合成改良的nirB,置换三启动子载体pTriEx-4中的T7Lac和P10启动子,而保留其CMVie启动子,获得携带CMVie和nirB双种启动子的新型载体pCMVnir,或称为pCN.构建pCN-EGFP和pCN-DsRed两种报告质粒,分别转化S. SL3261、E.coli DH5α和CHO等细胞,检测报告基因的表达情况以确定两种启动子的活性.pCN-EGFP转化S. SL3261,接种BALB/c小鼠,定期解剖小鼠收集黏膜相关淋巴组织,观察重组细菌和载体DNA在细胞中的定植及稳定性.免疫接种小鼠,并定期收集小鼠血清和阴道分泌物,以重组rEGFP为抗原,用ELISA方法研究其增强免疫应答的能力.并构建人乳头瘤病毒L1E7双启动子pCN-16L1E7及对照单启动子载体pCMV-16L1E7和pNir-16L1E7,对比三者诱导黏膜免疫的差别. 结果双启动子表达载体pCMVnir可在细菌和真核细胞中有效表达报告基因,在细菌中可形成肉眼可见的荧光菌落和沉淀,转染CHO等真核细胞能够表达荧光蛋白,表明pCMVnir载体的两种启动子都有活性,其中nirB活性是受兼性厌氧调控的.pCMVnir与细菌有较好的相容性,重组细菌可在动物体内有限复制和定植达6周,质粒可在细菌中稳定存在.以rEGFP为抗原检测发现pCN-EGFP诱导的免疫反应高于常用的单启动子载体pCMV-EGFP.人乳头瘤病毒双启动子载体pCN-16L1E7诱导的免疫反应也高于其他单启动子载体. 结论双启动子表达载体pCMVnir与减毒胞内寄生菌匹配应用,能够提高抗原表达量及增强基因免疫反应的强度.并可作为一般基因克隆和表达载体,特别是作为原核表达载体,不用添加诱导物,即可获得大量表达.
目的構建一種新型雙啟動子錶達載體pCMVnir,研究其與胞內寄生菌聯閤應用促進基因免疫效果的作用. 方法細菌硝痠鹽還原酶基因B啟動子nirB為厭氧誘導啟動子,根據nirB啟動子的結構,設計閤成改良的nirB,置換三啟動子載體pTriEx-4中的T7Lac和P10啟動子,而保留其CMVie啟動子,穫得攜帶CMVie和nirB雙種啟動子的新型載體pCMVnir,或稱為pCN.構建pCN-EGFP和pCN-DsRed兩種報告質粒,分彆轉化S. SL3261、E.coli DH5α和CHO等細胞,檢測報告基因的錶達情況以確定兩種啟動子的活性.pCN-EGFP轉化S. SL3261,接種BALB/c小鼠,定期解剖小鼠收集黏膜相關淋巴組織,觀察重組細菌和載體DNA在細胞中的定植及穩定性.免疫接種小鼠,併定期收集小鼠血清和陰道分泌物,以重組rEGFP為抗原,用ELISA方法研究其增彊免疫應答的能力.併構建人乳頭瘤病毒L1E7雙啟動子pCN-16L1E7及對照單啟動子載體pCMV-16L1E7和pNir-16L1E7,對比三者誘導黏膜免疫的差彆. 結果雙啟動子錶達載體pCMVnir可在細菌和真覈細胞中有效錶達報告基因,在細菌中可形成肉眼可見的熒光菌落和沉澱,轉染CHO等真覈細胞能夠錶達熒光蛋白,錶明pCMVnir載體的兩種啟動子都有活性,其中nirB活性是受兼性厭氧調控的.pCMVnir與細菌有較好的相容性,重組細菌可在動物體內有限複製和定植達6週,質粒可在細菌中穩定存在.以rEGFP為抗原檢測髮現pCN-EGFP誘導的免疫反應高于常用的單啟動子載體pCMV-EGFP.人乳頭瘤病毒雙啟動子載體pCN-16L1E7誘導的免疫反應也高于其他單啟動子載體. 結論雙啟動子錶達載體pCMVnir與減毒胞內寄生菌匹配應用,能夠提高抗原錶達量及增彊基因免疫反應的彊度.併可作為一般基因剋隆和錶達載體,特彆是作為原覈錶達載體,不用添加誘導物,即可穫得大量錶達.
목적구건일충신형쌍계동자표체재체pCMVnir,연구기여포내기생균연합응용촉진기인면역효과적작용. 방법세균초산염환원매기인B계동자nirB위염양유도계동자,근거nirB계동자적결구,설계합성개량적nirB,치환삼계동자재체pTriEx-4중적T7Lac화P10계동자,이보류기CMVie계동자,획득휴대CMVie화nirB쌍충계동자적신형재체pCMVnir,혹칭위pCN.구건pCN-EGFP화pCN-DsRed량충보고질립,분별전화S. SL3261、E.coli DH5α화CHO등세포,검측보고기인적표체정황이학정량충계동자적활성.pCN-EGFP전화S. SL3261,접충BALB/c소서,정기해부소서수집점막상관림파조직,관찰중조세균화재체DNA재세포중적정식급은정성.면역접충소서,병정기수집소서혈청화음도분비물,이중조rEGFP위항원,용ELISA방법연구기증강면역응답적능력.병구건인유두류병독L1E7쌍계동자pCN-16L1E7급대조단계동자재체pCMV-16L1E7화pNir-16L1E7,대비삼자유도점막면역적차별. 결과쌍계동자표체재체pCMVnir가재세균화진핵세포중유효표체보고기인,재세균중가형성육안가견적형광균락화침정,전염CHO등진핵세포능구표체형광단백,표명pCMVnir재체적량충계동자도유활성,기중nirB활성시수겸성염양조공적.pCMVnir여세균유교호적상용성,중조세균가재동물체내유한복제화정식체6주,질립가재세균중은정존재.이rEGFP위항원검측발현pCN-EGFP유도적면역반응고우상용적단계동자재체pCMV-EGFP.인유두류병독쌍계동자재체pCN-16L1E7유도적면역반응야고우기타단계동자재체. 결론쌍계동자표체재체pCMVnir여감독포내기생균필배응용,능구제고항원표체량급증강기인면역반응적강도.병가작위일반기인극륭화표체재체,특별시작위원핵표체재체,불용첨가유도물,즉가획득대량표체.
