中华微生物学和免疫学杂志
中華微生物學和免疫學雜誌
중화미생물학화면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY
2006年
4期
354-359
,共6页
大肠杆菌%LTKA63基因%LTB基因%克隆/表达载体构建%重组蛋白/表达%黏膜免疫%佐剂活性
大腸桿菌%LTKA63基因%LTB基因%剋隆/錶達載體構建%重組蛋白/錶達%黏膜免疫%佐劑活性
대장간균%LTKA63기인%LTB기인%극륭/표체재체구건%중조단백/표체%점막면역%좌제활성
目的构建大肠杆菌不耐热肠毒素A亚单位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突变体LTKA63及B亚单位(heat-labile enterotoxin subunit B,LTB)基因原核表达系统,确定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐剂活性.方法采用高保真PCR从大肠杆菌44815株基因组DNA中扩增LTA和LTB基因,采用定位突变技术构建LTKA63突变体,T-A克隆后测序.构建LTKA63和LTB原核表达载体,采用SDS-PAGE鉴定表达产物.采用三色流式细胞术确定rLTKA63激活T细胞途径,以GM1-ELISA检测rLTB结合牛GM1的能力.建立幽门螺杆菌SS1株小鼠感染模型,分别以幽门螺杆菌(Hp)重组尿素酶B亚单位(rUreB)和黏附素(rHpaA)为抗原,分别检测rLTKA63和rLTB对rUreB和rHpaA的免疫保护增强作用.结果从大肠杆菌44815株DNA模板中扩增获得预期大小的LTA和LTB基因条带.LTA基因定位突变后获得序列正确的LTKA63突变体.rLTKA63和rLTB表达量分别占细菌总蛋白的30%和20%左右.LTKA63作用后TH1和TH2细胞较阴性对照组分别增加19.9%和42.3%,GM1-ELISA结果证实rLTB能与牛GM1结合.33.3%(4/12)rUreB和41.7%(5/12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜标本中分离出幽门螺杆菌,且rUreB和rHpaA特异性S-IgA检测结果均为阴性.rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫后,小鼠胃黏膜标本中幽门螺杆菌分离阳性率下降为16.7%～25.0%(P＞0.05),rUreB和rHpaA特异性S-IgA阳性率可达41.6%～58.3%(P＜0.01).结论成功地构建了LTKA63和LTB原核表达系统,所表达的rLTKA63和rLTB均具有较强的黏膜免疫佐剂活性.
目的構建大腸桿菌不耐熱腸毒素A亞單位(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)突變體LTKA63及B亞單位(heat-labile enterotoxin subunit B,LTB)基因原覈錶達繫統,確定rLTKA63和rLTB黏膜免疫佐劑活性.方法採用高保真PCR從大腸桿菌44815株基因組DNA中擴增LTA和LTB基因,採用定位突變技術構建LTKA63突變體,T-A剋隆後測序.構建LTKA63和LTB原覈錶達載體,採用SDS-PAGE鑒定錶達產物.採用三色流式細胞術確定rLTKA63激活T細胞途徑,以GM1-ELISA檢測rLTB結閤牛GM1的能力.建立幽門螺桿菌SS1株小鼠感染模型,分彆以幽門螺桿菌(Hp)重組尿素酶B亞單位(rUreB)和黏附素(rHpaA)為抗原,分彆檢測rLTKA63和rLTB對rUreB和rHpaA的免疫保護增彊作用.結果從大腸桿菌44815株DNA模闆中擴增穫得預期大小的LTA和LTB基因條帶.LTA基因定位突變後穫得序列正確的LTKA63突變體.rLTKA63和rLTB錶達量分彆佔細菌總蛋白的30%和20%左右.LTKA63作用後TH1和TH2細胞較陰性對照組分彆增加19.9%和42.3%,GM1-ELISA結果證實rLTB能與牛GM1結閤.33.3%(4/12)rUreB和41.7%(5/12)rHpaA免疫小鼠胃黏膜標本中分離齣幽門螺桿菌,且rUreB和rHpaA特異性S-IgA檢測結果均為陰性.rUreB或rHpaA加用rLTKA63或rLTB免疫後,小鼠胃黏膜標本中幽門螺桿菌分離暘性率下降為16.7%～25.0%(P＞0.05),rUreB和rHpaA特異性S-IgA暘性率可達41.6%～58.3%(P＜0.01).結論成功地構建瞭LTKA63和LTB原覈錶達繫統,所錶達的rLTKA63和rLTB均具有較彊的黏膜免疫佐劑活性.
목적구건대장간균불내열장독소A아단위(heat-labile enterotoxin subunit A,LTA)돌변체LTKA63급B아단위(heat-labile enterotoxin subunit B,LTB)기인원핵표체계통,학정rLTKA63화rLTB점막면역좌제활성.방법채용고보진PCR종대장간균44815주기인조DNA중확증LTA화LTB기인,채용정위돌변기술구건LTKA63돌변체,T-A극륭후측서.구건LTKA63화LTB원핵표체재체,채용SDS-PAGE감정표체산물.채용삼색류식세포술학정rLTKA63격활T세포도경,이GM1-ELISA검측rLTB결합우GM1적능력.건립유문라간균SS1주소서감염모형,분별이유문라간균(Hp)중조뇨소매B아단위(rUreB)화점부소(rHpaA)위항원,분별검측rLTKA63화rLTB대rUreB화rHpaA적면역보호증강작용.결과종대장간균44815주DNA모판중확증획득예기대소적LTA화LTB기인조대.LTA기인정위돌변후획득서렬정학적LTKA63돌변체.rLTKA63화rLTB표체량분별점세균총단백적30%화20%좌우.LTKA63작용후TH1화TH2세포교음성대조조분별증가19.9%화42.3%,GM1-ELISA결과증실rLTB능여우GM1결합.33.3%(4/12)rUreB화41.7%(5/12)rHpaA면역소서위점막표본중분리출유문라간균,차rUreB화rHpaA특이성S-IgA검측결과균위음성.rUreB혹rHpaA가용rLTKA63혹rLTB면역후,소서위점막표본중유문라간균분리양성솔하강위16.7%～25.0%(P＞0.05),rUreB화rHpaA특이성S-IgA양성솔가체41.6%～58.3%(P＜0.01).결론성공지구건료LTKA63화LTB원핵표체계통,소표체적rLTKA63화rLTB균구유교강적점막면역좌제활성.
