同源重组法制备口蹄疫病毒多基因重组腺病毒
동원중조법제비구제역병독다기인중조선병독
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    2009年 9期 14-16 ,共3页

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    通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有O型口蹄疫病毒P1-2A和3C蛋白酶基因和3D基因的重组腺病毒表达载体.首先将P12A、5C和3D基因亚克隆连接到穿梭质粒pShuttle-CMV上,再将重组穿梭质柱用Pmel线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态菌,经细菌内同源重组产生pAdcmv-p12×3c和pAdcrnv-p12×3cd重组腺病毒质粒,经序列测定证实目的基因已正确的插入到腺病毒骨架载体中.重组腺病毒质柱经Pacl线性化后转染HEK293细胞,转染1w内细胞出现典型病变.取转染细胞裂解液上清连续传代至第4代时,细胞于24～48h内即病变完全,收取接毒后24h细胞进行PCR和RT-PCR检测,表明目的基因已整合到腺病毒基因组内,且在mRNA水平上有表达.取第4,6、8和10代病毒,用蛋白酶K处理后可扩增出目的基因,证明此重组病毒可稳定存在.本研究为FMDV腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.
    통과세균내동원중조적방법성공구건료함유O형구제역병독P1-2A화3C단백매기인화3D기인적중조선병독표체재체.수선장P12A、5C화3D기인아극륭련접도천사질립pShuttle-CMV상,재장중조천사질주용Pmel선성화후전전화휴대유선병독골가재체pAdeasy-1적대장간균BJ5183감수태균,경세균내동원중조산생pAdcmv-p12×3c화pAdcrnv-p12×3cd중조선병독질립,경서렬측정증실목적기인이정학적삽입도선병독골가재체중.중조선병독질주경Pacl선성화후전염HEK293세포,전염1w내세포출현전형병변.취전염세포렬해액상청련속전대지제4대시,세포우24～48h내즉병변완전,수취접독후24h세포진행PCR화RT-PCR검측,표명목적기인이정합도선병독기인조내,차재mRNA수평상유표체.취제4,6、8화10대병독,용단백매K처리후가확증출목적기인,증명차중조병독가은정존재.본연구위FMDV선병독활재체역묘적연구전정료기출.
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