CAJ | 학술논문

从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5'-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3'为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA(fcDNA).根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因.PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆.再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2(1-5).将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析.结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807～819 bp,编码约269～273个氨基酸.采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定.本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础.
종계비장중제취총RNA,이총RNA위모판,5'-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3'위반전록인물,채용TaKaRa AMV반전록매합성First-strand cDNA(fcDNA).근거GenBank중등록적계적BF2기인포외구서렬,설계료함EcoR Ⅰ화Hind Ⅲ매절위점적2대인물,분별확증계BF2적포외구기인.PCR산물경순화회수후,삽입도함LacZ기인적원핵극륭재체pGEM-T Easy중,전화지대장간균JM109감수태세포,경EcoR Ⅰ화Hind Ⅲ쌍매절급PCR감정,사선출양성극륭.재파소극륭적편단아극륭도표체재체pMAL-p2X vector,구건중조질립p2X/BF2(1-5).장중조표체질립전화입대장간균TB1감수태세포,사선양성극륭,경IPTG유도표체후,진행취병희선알응효전영(SDS-PAGE)분석.결과표명,본연구극륭료5류계BF2적포외구기인서렬,시험결과증명본연구이성공극륭병가용성표체료5류BF2포외구단백질분자,전장약807～819 bp,편마약269～273개안기산.채용정분수지주친화층석화DEAE응효과려방법대표체산물진행료순화,병대순화적표체산물진행료western blot감정.본연구위진일보이용BF2적포외구재체외구건MHC Ⅰ류분자결합사선항원표위태평태전정료기출.