免疫学杂志
免疫學雜誌
면역학잡지
IMMUNOLOGICAL JOURNAL
2007年
1期
84-87
,共4页
陈吉泉%修清玉%刘涛%何皓(頔)%颜泽敏
陳吉泉%脩清玉%劉濤%何皓(頔)%顏澤敏
진길천%수청옥%류도%하호(적)%안택민
T-bet%AdEasy系统%基因治疗%腺病毒载体
T-bet%AdEasy繫統%基因治療%腺病毒載體
T-bet%AdEasy계통%기인치료%선병독재체
目的 构建小鼠T-bet基因重组腺病毒.方法 采用RT-PCR方法从小鼠脾脏活化的T淋巴细胞中扩增的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒,酶切线性化后,与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-l以电穿孔的方法共转化大肠杆菌BJ5183进行同源重组,经酶切鉴定筛选正确重组子,以线性化重组质粒转染293细胞,制备重组腺病毒小鼠T-bet重组腺病毒AdT-bet,最后以PCR及Western blot方法鉴定T-bet的表达.结果 感受态大肠杆菌BJ5183细菌内同源重组24 h后共获得35%阳性重组质粒克隆,经酶切获得一个30 kb的大片段和一个4.5 kb的小片断.该质粒转染293细胞后获得的重组腺病毒可高效表达T-bet,纯化后病毒滴度为2.0×1011 PFU/mL.结论 应用细菌内同源重组法成功快捷构建了含小鼠T-bet基因的重组腺病毒,所获得的AdT-bet可进一步应用支气管哮喘等疾病的基因治疗研究.
目的 構建小鼠T-bet基因重組腺病毒.方法 採用RT-PCR方法從小鼠脾髒活化的T淋巴細胞中擴增的cDNA序列,併將其剋隆至穿梭質粒pShuttle-CMV中,形成轉移質粒,酶切線性化後,與超螺鏇腺病毒骨架質粒pAdEasy-l以電穿孔的方法共轉化大腸桿菌BJ5183進行同源重組,經酶切鑒定篩選正確重組子,以線性化重組質粒轉染293細胞,製備重組腺病毒小鼠T-bet重組腺病毒AdT-bet,最後以PCR及Western blot方法鑒定T-bet的錶達.結果 感受態大腸桿菌BJ5183細菌內同源重組24 h後共穫得35%暘性重組質粒剋隆,經酶切穫得一箇30 kb的大片段和一箇4.5 kb的小片斷.該質粒轉染293細胞後穫得的重組腺病毒可高效錶達T-bet,純化後病毒滴度為2.0×1011 PFU/mL.結論 應用細菌內同源重組法成功快捷構建瞭含小鼠T-bet基因的重組腺病毒,所穫得的AdT-bet可進一步應用支氣管哮喘等疾病的基因治療研究.
목적 구건소서T-bet기인중조선병독.방법 채용RT-PCR방법종소서비장활화적T림파세포중확증적cDNA서렬,병장기극륭지천사질립pShuttle-CMV중,형성전이질립,매절선성화후,여초라선선병독골가질립pAdEasy-l이전천공적방법공전화대장간균BJ5183진행동원중조,경매절감정사선정학중조자,이선성화중조질립전염293세포,제비중조선병독소서T-bet중조선병독AdT-bet,최후이PCR급Western blot방법감정T-bet적표체.결과 감수태대장간균BJ5183세균내동원중조24 h후공획득35%양성중조질립극륭,경매절획득일개30 kb적대편단화일개4.5 kb적소편단.해질립전염293세포후획득적중조선병독가고효표체T-bet,순화후병독적도위2.0×1011 PFU/mL.결론 응용세균내동원중조법성공쾌첩구건료함소서T-bet기인적중조선병독,소획득적AdT-bet가진일보응용지기관효천등질병적기인치료연구.
