CAJ | 학술논문

为了构建适合大多数基因座位点打靶的通用型基因打靶载体及打靶成功后去除正选择标记基因,以克隆载体pGEM-3Z为骨架,插入了一个正选择标记基因新霉素磷酸转移酶基因(neo).两个相同的负选择标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-tk1和HSV-tk2,并在neo的两侧各添加了一个方向相同的LoxP(10cus of crossing-over(X)in P1)序列及两个不同的多克隆位点序列,从而构建了载体pA2T.插入的两个不同的多克隆位点序列中,neo和HSV-tk1之间的多克隆位点序列有8个稀少的酶切位点、neo和HSV-tk2之间的多克隆位点序列有5个稀少的酶切位点,neo、HSV-tk1和HSV-tk2有各自独立的转录单元.脂质体法转染山羊成纤维细胞,用遗传霉素(G418)和丙氧鸟苷(GAC)进行正负筛选,验证了正负选择标记基因的生物活性,证明通用型基因打靶载体pA2T构建成功.栽体pA2T转化组成性表达Cre重组醇(Cyclization recombination protein)的大肠杆菌BM25.8,检测到LoxP序列的生物活性,结果表明pA2T中的正选基因可以被Cre重组酶去除.因此,本研究所构建的通用型基因打靶载体pA2T,根据不同的基因座设计同源臂后,插入到MCS中可直接用于不同基因座位点的打靶,并能够在打靶成功后用Cre重组酶去除基因组中插入的neo基因,为用基因打靶的方法制作转基因动物提供了便利.
위료구건괄합대다수기인좌위점타파적통용형기인타파재체급타파성공후거제정선택표기기인,이극륭재체pGEM-3Z위골가,삽입료일개정선택표기기인신매소린산전이매기인(neo).량개상동적부선택표기기인단순포진병독흉감격매기인HSV-tk1화HSV-tk2,병재neo적량측각첨가료일개방향상동적LoxP(10cus of crossing-over(X)in P1)서렬급량개불동적다극륭위점서렬,종이구건료재체pA2T.삽입적량개불동적다극륭위점서렬중,neo화HSV-tk1지간적다극륭위점서렬유8개희소적매절위점、neo화HSV-tk2지간적다극륭위점서렬유5개희소적매절위점,neo、HSV-tk1화HSV-tk2유각자독립적전록단원.지질체법전염산양성섬유세포,용유전매소(G418)화병양조감(GAC)진행정부사선,험증료정부선택표기기인적생물활성,증명통용형기인타파재체pA2T구건성공.재체pA2T전화조성성표체Cre중조순(Cyclization recombination protein)적대장간균BM25.8,검측도LoxP서렬적생물활성,결과표명pA2T중적정선기인가이피Cre중조매거제.인차,본연구소구건적통용형기인타파재체pA2T,근거불동적기인좌설계동원비후,삽입도MCS중가직접용우불동기인좌위점적타파,병능구재타파성공후용Cre중조매거제기인조중삽입적neo기인,위용기인타파적방법제작전기인동물제공료편리.