CAJ | 학술논문

目的制备携带人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因的重组AAV2病毒(rAAV2/hFⅨ),并对用rAAV2/hFⅨ肌肉注射治疗血友病B模型小鼠的疗效进行评价.方法通过"一株载体细胞/一株辅助病毒"的双因素包装策略制备出rAAV2/hFⅨ,体外转导BHK-21、C2C12细胞后,检测细胞培养上清中hFⅨ的表达量;肌肉直接注射血友病B模型小鼠后,检测其血浆中hFⅨ的抗原水平和凝血活性等指标.结果转导24 h后在细胞上清中即可检测到hFⅨ,连续检测120 h都有表达,BHK-21、C2C1 2细胞24 h最高表达量分别达到(51.0±6.5)ng/105细胞和(68.0±7.2)ng/105细胞.rAAV2/hFⅨ经肌肉直接注射后,高、中、低三个剂量组均能检测到小鼠体内高效表达hFⅨ,在给药后第3周达到高峰,小鼠血浆中hFⅨ的表达量与对照组比较差异有显著性(P＜0.01),之后缓慢下降,到第10周仍可检测到低水平hFⅨ表达;取第3周小鼠血浆样品检测凝血功能,高、中、低剂量组FⅨ活性均得到明显改善,小鼠的割尾实验出血时间明显缩短,5 min失血量也相应显著减少,其中高剂量组hFⅨ最高表达量达到(387.0±12.5)ng/ml血浆,FⅨ活性达到正常水平的(30.0±5.5)%;给药后第10周,除在注射点外,其它主要脏器均未检测到AAV载体DNA.结论制备的rAAV2/hFⅨ病毒在体外培养细胞中能高水平表达hFⅨ,肌肉注射能有效治疗血友病B模型小鼠,为临床应用该基因治疗血友病B提供了科学依据.
목적제비휴대인응혈인자Ⅸ(hFⅨ)기인적중조AAV2병독(rAAV2/hFⅨ),병대용rAAV2/hFⅨ기육주사치료혈우병B모형소서적료효진행평개.방법통과"일주재체세포/일주보조병독"적쌍인소포장책략제비출rAAV2/hFⅨ,체외전도BHK-21、C2C12세포후,검측세포배양상청중hFⅨ적표체량;기육직접주사혈우병B모형소서후,검측기혈장중hFⅨ적항원수평화응혈활성등지표.결과전도24 h후재세포상청중즉가검측도hFⅨ,련속검측120 h도유표체,BHK-21、C2C1 2세포24 h최고표체량분별체도(51.0±6.5)ng/105세포화(68.0±7.2)ng/105세포.rAAV2/hFⅨ경기육직접주사후,고、중、저삼개제량조균능검측도소서체내고효표체hFⅨ,재급약후제3주체도고봉,소서혈장중hFⅨ적표체량여대조조비교차이유현저성(P＜0.01),지후완만하강,도제10주잉가검측도저수평hFⅨ표체;취제3주소서혈장양품검측응혈공능,고、중、저제량조FⅨ활성균득도명현개선,소서적할미실험출혈시간명현축단,5 min실혈량야상응현저감소,기중고제량조hFⅨ최고표체량체도(387.0±12.5)ng/ml혈장,FⅨ활성체도정상수평적(30.0±5.5)%;급약후제10주,제재주사점외,기타주요장기균미검측도AAV재체DNA.결론제비적rAAV2/hFⅨ병독재체외배양세포중능고수평표체hFⅨ,기육주사능유효치료혈우병B모형소서,위림상응용해기인치료혈우병B제공료과학의거.