CAJ | 학술논문

目的:克隆人T-bet基因,构建其真核表达载体pEGFP-C1-T-bet.方法:实验于2005-07/2006-07在北京大学深圳医院中心实验室完成.①根据Genebank的人T-bet基因的全长cDNA序列,设计合成一对附加BglⅡ和SalⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物.②分离人外周血单个核细胞,提取RNA,用反转录-聚合酶链反应方法将T-bet的编码序列cDNA扩增,装入pMD18-T载体并送去测序.③BglⅡ+SalⅠ双酶切质粒pMD18-T-bet,经琼脂糖电泳切胶回收T-bet片段,将T-bet插入载体pEGFP-C1构建成重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet.④用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证.结果:①反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为1 608 bp的特异性扩增带.②测序结果证实,T-bet的编码序列和Genbank中T-bet mRNA序列相同.③双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确.结论:实验成功扩增出人T-bet基因,构建了基因重组真核表达载体pEGFP-C1-T-bet,为探索T-bet基因对免疫细胞的调节作用和肿瘤基因治疗奠定了基础.
목적:극륭인T-bet기인,구건기진핵표체재체pEGFP-C1-T-bet.방법:실험우2005-07/2006-07재북경대학심수의원중심실험실완성.①근거Genebank적인T-bet기인적전장cDNA서렬,설계합성일대부가BglⅡ화SalⅠ량개한제성내절매매절위점적특이성인물.②분리인외주혈단개핵세포,제취RNA,용반전록-취합매련반응방법장T-bet적편마서렬cDNA확증,장입pMD18-T재체병송거측서.③BglⅡ+SalⅠ쌍매절질립pMD18-T-bet,경경지당전영절효회수T-bet편단,장T-bet삽입재체pEGFP-C1구건성중조진핵표체재체pEGFP-C1-T-bet.④용쌍매절화취합매련반응대삽입편단진행분석화험증.결과:①반전록-취합매련반응산물경경지당전영결과현시재예기위치유상대분자질량위1 608 bp적특이성확증대.②측서결과증실,T-bet적편마서렬화Genbank중T-bet mRNA서렬상동.③쌍매절화취합매련반응결과증실삽입편단서렬정학.결론:실험성공확증출인T-bet기인,구건료기인중조진핵표체재체pEGFP-C1-T-bet,위탐색T-bet기인대면역세포적조절작용화종류기인치료전정료기출.