CAJ | 학술논문

背景:目前多数芯片采用玻璃片基,以Cy3和Cy5标记,价格高,主要用于科研,但不能在临床上大规模推广应用.课题组采用尼龙膜为载体制作基因芯片,以期获得一种具有高灵敏度和准确性、快速简便、可同时检测多种疾病且成本低的芯片.目的:对以尼龙膜为载体基因芯片的町行性进行检测,同时对所用探针及目的基因的量进行优化.设计、时间及地点:基因工程探针设计,于2005-10/2006-09在兰大科技园百源基因公司实验室完成.材料:甘肃省肿瘤医院2005-10/2006-04切除的新鲜大肠癌标本,取距肿瘤边缘5-10 cm以上的正常组织作为对照,病理证实无癌细胞浸润.尼龙膜带正电荷,购自Amersco公司.方法:从液氮中取出冻存的新鲜组织200 mg,采用 Trizol法提取组织总RNA,并用Oligo dT纤维索层析法纯化mRNA.使用TaKaRa的M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit(code D6130)反转录合成cDNA的第1,2链,产物分为两部分,一部分作为模板进行地高辛标记PCR,所得产物作为日的基因,另一部分作为制备探针的模板.对获得的GAPDH,Actin,CyclinD1三种基因片段PCR产物进行纯化.以带正电荷的尼龙膜为载体,将不同浓度的二种基因片段作为探针点于其上,所得芯片分别与不同浓度的地高辛标记日的基因进行杂交.结果:目的基因取2.5μL,1.25μL时,加入杂交液后因目的基因的浓度太小,造成各点探针密度相对较高,而无法反映出正确的显色趋势.目的基因取5 μL时,探针密度为10-20 μL情况下3种探针显色深度较恰当的反映了由强到弱的趋势,ACTIN＞CyclinD1＞GAPDH.目的基因取10 μL时,探针取15 μL,20 μL的量能较为合理的反映由强到弱的趋势.目的基因取20 μL时,此时杂交液中目的基因的浓度对于ACTIN和CyclinD1过高,不能明显反映二者着色深浅变化.结论:以尼龙膜为载体的基因芯片本底清晰,合理目的基因用量为5 μL,与其相匹配的优化探针用量为10～20 μL. 揹景:目前多數芯片採用玻璃片基,以Cy3和Cy5標記,價格高,主要用于科研,但不能在臨床上大規模推廣應用.課題組採用尼龍膜為載體製作基因芯片,以期穫得一種具有高靈敏度和準確性、快速簡便、可同時檢測多種疾病且成本低的芯片.目的:對以尼龍膜為載體基因芯片的町行性進行檢測,同時對所用探針及目的基因的量進行優化.設計、時間及地點:基因工程探針設計,于2005-10/2006-09在蘭大科技園百源基因公司實驗室完成.材料:甘肅省腫瘤醫院2005-10/2006-04切除的新鮮大腸癌標本,取距腫瘤邊緣5-10 cm以上的正常組織作為對照,病理證實無癌細胞浸潤.尼龍膜帶正電荷,購自Amersco公司.方法:從液氮中取齣凍存的新鮮組織200 mg,採用 Trizol法提取組織總RNA,併用Oligo dT纖維索層析法純化mRNA.使用TaKaRa的M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit(code D6130)反轉錄閤成cDNA的第1,2鏈,產物分為兩部分,一部分作為模闆進行地高辛標記PCR,所得產物作為日的基因,另一部分作為製備探針的模闆.對穫得的GAPDH,Actin,CyclinD1三種基因片段PCR產物進行純化.以帶正電荷的尼龍膜為載體,將不同濃度的二種基因片段作為探針點于其上,所得芯片分彆與不同濃度的地高辛標記日的基因進行雜交.結果:目的基因取2.5μL,1.25μL時,加入雜交液後因目的基因的濃度太小,造成各點探針密度相對較高,而無法反映齣正確的顯色趨勢.目的基因取5 μL時,探針密度為10-20 μL情況下3種探針顯色深度較恰噹的反映瞭由彊到弱的趨勢,ACTIN＞CyclinD1＞GAPDH.目的基因取10 μL時,探針取15 μL,20 μL的量能較為閤理的反映由彊到弱的趨勢.目的基因取20 μL時,此時雜交液中目的基因的濃度對于ACTIN和CyclinD1過高,不能明顯反映二者著色深淺變化.結論:以尼龍膜為載體的基因芯片本底清晰,閤理目的基因用量為5 μL,與其相匹配的優化探針用量為10～20 μL.
배경:목전다수심편채용파리편기,이Cy3화Cy5표기,개격고,주요용우과연,단불능재림상상대규모추엄응용.과제조채용니룡막위재체제작기인심편,이기획득일충구유고령민도화준학성、쾌속간편、가동시검측다충질병차성본저적심편.목적:대이니룡막위재체기인심편적정행성진행검측,동시대소용탐침급목적기인적량진행우화.설계、시간급지점:기인공정탐침설계,우2005-10/2006-09재란대과기완백원기인공사실험실완성.재료:감숙성종류의원2005-10/2006-04절제적신선대장암표본,취거종류변연5-10 cm이상적정상조직작위대조,병리증실무암세포침윤.니룡막대정전하,구자Amersco공사.방법:종액담중취출동존적신선조직200 mg,채용 Trizol법제취조직총RNA,병용Oligo dT섬유색층석법순화mRNA.사용TaKaRa적M-MLV Rtase cDNA synthesis Kit(code D6130)반전록합성cDNA적제1,2련,산물분위량부분,일부분작위모판진행지고신표기PCR,소득산물작위일적기인,령일부분작위제비탐침적모판.대획득적GAPDH,Actin,CyclinD1삼충기인편단PCR산물진행순화.이대정전하적니룡막위재체,장불동농도적이충기인편단작위탐침점우기상,소득심편분별여불동농도적지고신표기일적기인진행잡교.결과:목적기인취2.5μL,1.25μL시,가입잡교액후인목적기인적농도태소,조성각점탐침밀도상대교고,이무법반영출정학적현색추세.목적기인취5 μL시,탐침밀도위10-20 μL정황하3충탐침현색심도교흡당적반영료유강도약적추세,ACTIN＞CyclinD1＞GAPDH.목적기인취10 μL시,탐침취15 μL,20 μL적량능교위합리적반영유강도약적추세.목적기인취20 μL시,차시잡교액중목적기인적농도대우ACTIN화CyclinD1과고,불능명현반영이자착색심천변화.결론:이니룡막위재체적기인심편본저청석,합리목적기인용량위5 μL,여기상필배적우화탐침용량위10～20 μL.