南方医科大学学报
南方醫科大學學報
남방의과대학학보
JOURNAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY
2006年
12期
1715-1719
,共5页
王全师%王欣璐%李华%王巧愚%王全颖%杨广笑
王全師%王訢璐%李華%王巧愚%王全穎%楊廣笑
왕전사%왕흔로%리화%왕교우%왕전영%양엄소
RNA干扰%逆转录病毒载体%人端粒酶逆转录酶
RNA榦擾%逆轉錄病毒載體%人耑粒酶逆轉錄酶
RNA간우%역전록병독재체%인단립매역전록매
目的 构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体.方法 采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆人真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定.以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况.以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果.结果 限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT.以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24 h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%.重组逆转录病毒感染人Hela细胞48 h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%.结论 成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础.
目的 構建靶嚮性榦擾人耑粒酶逆轉錄酶錶達的特異性小榦擾RNA的真覈錶達載體.方法 採用PCR法分彆擴增增彊型綠色熒光蛋白的DNA序列、U6啟動子序列和靶嚮性榦擾人耑粒酶逆轉錄酶的特異性小榦擾RNA對應的DNA序列,隨後將與之相應的DNA序列片斷依次剋隆人真覈錶達載體pLXSN中,併通過限製性內切酶和測序對該重組錶達載體進行鑒定.以熒光顯微鏡和利用流式細胞儀分析重組病毒錶達EGFP蛋白的情況.以MTT方法檢測初步分析重組病毒對人Hela細胞的RNAi效果.結果 限製性內切酶酶切和測序結果均錶明成功構建瞭靶嚮人耑粒酶逆轉錄酶的小榦擾RNA的逆轉錄病毒錶達載體pLXSN/EGFP-U6-siTERT.以燐痠鈣共轉染法製備的重組逆轉錄病毒滴定瞭病毒滴度後,重組病毒感染人Hela細胞24 h時用流式細胞儀測得EGFP錶達的暘性率為24.1%.重組逆轉錄病毒感染人Hela細胞48 h時,MTT實驗測得細胞死亡率為53.2%.結論 成功構建瞭針對人耑粒酶逆轉錄酶小榦擾RNA的逆轉錄病毒錶達載體pLXSN/EGFP-U6-siTERT,併製備瞭重組逆轉錄病毒,初步觀察瞭效應,為進一步利用小榦擾RNA技術研究腫瘤的基因治療奠定瞭基礎.
목적 구건파향성간우인단립매역전록매표체적특이성소간우RNA적진핵표체재체.방법 채용PCR법분별확증증강형록색형광단백적DNA서렬、U6계동자서렬화파향성간우인단립매역전록매적특이성소간우RNA대응적DNA서렬,수후장여지상응적DNA서렬편단의차극륭인진핵표체재체pLXSN중,병통과한제성내절매화측서대해중조표체재체진행감정.이형광현미경화이용류식세포의분석중조병독표체EGFP단백적정황.이MTT방법검측초보분석중조병독대인Hela세포적RNAi효과.결과 한제성내절매매절화측서결과균표명성공구건료파향인단립매역전록매적소간우RNA적역전록병독표체재체pLXSN/EGFP-U6-siTERT.이린산개공전염법제비적중조역전록병독적정료병독적도후,중조병독감염인Hela세포24 h시용류식세포의측득EGFP표체적양성솔위24.1%.중조역전록병독감염인Hela세포48 h시,MTT실험측득세포사망솔위53.2%.결론 성공구건료침대인단립매역전록매소간우RNA적역전록병독표체재체pLXSN/EGFP-U6-siTERT,병제비료중조역전록병독,초보관찰료효응,위진일보이용소간우RNA기술연구종류적기인치료전정료기출.
