中华实验外科杂志
中華實驗外科雜誌
중화실험외과잡지
CHINESE JOURNAL OF EXPERIMENTAL SURGERY
2007年
12期
1557-1559
,共3页
于维东%胡新华%范红杰%杨军%李铁民%张强
于維東%鬍新華%範紅傑%楊軍%李鐵民%張彊
우유동%호신화%범홍걸%양군%리철민%장강
蛋白激酶B%短发夹环RNA%血管%平滑肌细胞
蛋白激酶B%短髮夾環RNA%血管%平滑肌細胞
단백격매B%단발협배RNA%혈관%평활기세포
目的 构建靶向蛋白激酶B(PKB/Akt)基因的逆转录病毒RNA干扰表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响.方法 针对大鼠PKB/Akt基因序列(NM_033230)设计多个短发夹环RNA(shRNA)序列,化学合成法合成单链寡核苷酸序列,pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列插入逆转录病毒载体pLKIN,脂质体介导转染包装细胞PT67后获得PKB/Akt的重组逆转录病毒RNA干扰载体,感染血管平滑肌细胞(VSMC),Northern blot和Western blot法检测Akt及其下游底物-核糖体蛋白S6激酶(p70s6k)等表达的变化,流式细胞仪检测VSMC细胞周期的变化,噻唑盐(MTT)比色法检测VSMC增殖活性的改变.结果 shRNA序列经T载体克隆,酶切确定该片段为PKB/Akt基因shRNA序列;感染VSMC,证实其能够显著抑制PKB/Akt的mRNA和蛋白产物表达,下游的p70s6k表达相应减少;被感染VSMC的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在G0/G1期.结论 成功构建PKB/Akt基因逆转录病毒shRNA载体,感染VSMC能够明显抑制其分裂、分化和增殖.
目的 構建靶嚮蛋白激酶B(PKB/Akt)基因的逆轉錄病毒RNA榦擾錶達載體,觀察其對血管平滑肌細胞(VSMC)增殖活性的影響.方法 針對大鼠PKB/Akt基因序列(NM_033230)設計多箇短髮夾環RNA(shRNA)序列,化學閤成法閤成單鏈寡覈苷痠序列,pGEM-T載體剋隆後雙酶切,將cDNA序列插入逆轉錄病毒載體pLKIN,脂質體介導轉染包裝細胞PT67後穫得PKB/Akt的重組逆轉錄病毒RNA榦擾載體,感染血管平滑肌細胞(VSMC),Northern blot和Western blot法檢測Akt及其下遊底物-覈糖體蛋白S6激酶(p70s6k)等錶達的變化,流式細胞儀檢測VSMC細胞週期的變化,噻唑鹽(MTT)比色法檢測VSMC增殖活性的改變.結果 shRNA序列經T載體剋隆,酶切確定該片段為PKB/Akt基因shRNA序列;感染VSMC,證實其能夠顯著抑製PKB/Akt的mRNA和蛋白產物錶達,下遊的p70s6k錶達相應減少;被感染VSMC的分裂、增殖過程受阻,更多細胞停滯在G0/G1期.結論 成功構建PKB/Akt基因逆轉錄病毒shRNA載體,感染VSMC能夠明顯抑製其分裂、分化和增殖.
목적 구건파향단백격매B(PKB/Akt)기인적역전록병독RNA간우표체재체,관찰기대혈관평활기세포(VSMC)증식활성적영향.방법 침대대서PKB/Akt기인서렬(NM_033230)설계다개단발협배RNA(shRNA)서렬,화학합성법합성단련과핵감산서렬,pGEM-T재체극륭후쌍매절,장cDNA서렬삽입역전록병독재체pLKIN,지질체개도전염포장세포PT67후획득PKB/Akt적중조역전록병독RNA간우재체,감염혈관평활기세포(VSMC),Northern blot화Western blot법검측Akt급기하유저물-핵당체단백S6격매(p70s6k)등표체적변화,류식세포의검측VSMC세포주기적변화,새서염(MTT)비색법검측VSMC증식활성적개변.결과 shRNA서렬경T재체극륭,매절학정해편단위PKB/Akt기인shRNA서렬;감염VSMC,증실기능구현저억제PKB/Akt적mRNA화단백산물표체,하유적p70s6k표체상응감소;피감염VSMC적분렬、증식과정수조,경다세포정체재G0/G1기.결론 성공구건PKB/Akt기인역전록병독shRNA재체,감염VSMC능구명현억제기분렬、분화화증식.
