CAJ | 학술논문

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化.方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白.结果 PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别.结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白.
목적구건결핵분지간균esat-6기인원핵표체재체,사기재대장간균중표체융합중조단백,병순화.방법용PCR방법종결핵분지간균H37Rv기인조중확증출esat-6기인편단,극륭지pMD18-T재체,PCR사선양성극륭병측서;용한제성내절매소화후,목적편단아극륭지표체재체pGEX-4T-2,구건pGEX-esat-6중조질립,장기전화입대장간균JM109;PCR화쌍매절감정전화균락;장양성균주경IPTG유도,SDS-PAGE화면역인적분석파단백적표체;용곡광감태-경지당친합층석법순화융합단백.결과 PCR확증출esat-6 288bp적기인,극륭도pMD18-T재체중,경측서여GenBank중서렬일치;수후아극륭도표체재체pGEX-4T-2구건중조표체질립,재JM109중표체료ESAT-6융합단백,표체적단백능피GST면역혈청식별;통과친화층석순화획득적단백능피결핵병인혈청식별.결론성공구건esat-6중조표체질립,해질립재JM109중표체ESAT-6융합단백,병획득교순적단백.