微生物学通报
微生物學通報
미생물학통보
MICROBIOLOGY
2008年
4期
539-544
,共6页
申艳敏%魏建超%尚书文%牛明福%周玉珍%周斌%曹瑞兵%陈溥言%侯继波
申豔敏%魏建超%尚書文%牛明福%週玉珍%週斌%曹瑞兵%陳溥言%侯繼波
신염민%위건초%상서문%우명복%주옥진%주빈%조서병%진부언%후계파
抗菌肽LL-37%基因设计%分泌表达%活性检测
抗菌肽LL-37%基因設計%分泌錶達%活性檢測
항균태LL-37%기인설계%분비표체%활성검측
根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列,选择毕赤酵母偏好密码子,采用SOE 方法合成了人源抗菌肽LL-37基因.所合成的LL-37基因全长为141 bp,并在其N端引入kex2裂解位点,以保证表达抗茵肽具有天然N端.基因克隆入pPICZα-A质粒,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα-A-LL-37.pPICZα-A-LL-37经Sac Ⅰ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33.PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌LL-37于发酵上清液,其表达量为206mg/L.表达产物LL-37耐热性强,在100℃条件下40 min内抗茵活性不变,煮沸3 h以上仍具有活性.琼脂糖孔穴扩散法检测显示LL-37对多种革兰氏阴性茵和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌Cowan I (Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)分别为1.56 μg/mL、3.12 μg/mL和1.56 μg/mL.
根據GenBank CAA86115中的LL-37氨基痠序列,選擇畢赤酵母偏好密碼子,採用SOE 方法閤成瞭人源抗菌肽LL-37基因.所閤成的LL-37基因全長為141 bp,併在其N耑引入kex2裂解位點,以保證錶達抗茵肽具有天然N耑.基因剋隆入pPICZα-A質粒,構建分泌型重組酵母錶達載體pPICZα-A-LL-37.pPICZα-A-LL-37經Sac Ⅰ酶切線性化後電轉化導入畢赤酵母菌株X-33.PCR鑒定為暘性的酵母轉化子經甲醇誘導分泌LL-37于髮酵上清液,其錶達量為206mg/L.錶達產物LL-37耐熱性彊,在100℃條件下40 min內抗茵活性不變,煮沸3 h以上仍具有活性.瓊脂糖孔穴擴散法檢測顯示LL-37對多種革蘭氏陰性茵和暘性菌均具有很好的抑製活性,其對金黃色葡萄毬菌Cowan I (Staphylococcus aureus)、緻病性大腸桿菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鷄白痢沙門氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)分彆為1.56 μg/mL、3.12 μg/mL和1.56 μg/mL.
근거GenBank CAA86115중적LL-37안기산서렬,선택필적효모편호밀마자,채용SOE 방법합성료인원항균태LL-37기인.소합성적LL-37기인전장위141 bp,병재기N단인입kex2렬해위점,이보증표체항인태구유천연N단.기인극륭입pPICZα-A질립,구건분비형중조효모표체재체pPICZα-A-LL-37.pPICZα-A-LL-37경Sac Ⅰ매절선성화후전전화도입필적효모균주X-33.PCR감정위양성적효모전화자경갑순유도분비LL-37우발효상청액,기표체량위206mg/L.표체산물LL-37내열성강,재100℃조건하40 min내항인활성불변,자비3 h이상잉구유활성.경지당공혈확산법검측현시LL-37대다충혁란씨음성인화양성균균구유흔호적억제활성,기대금황색포도구균Cowan I (Staphylococcus aureus)、치병성대장간균K99(Enteropathogenic E.coli)화계백리사문씨균(Salmonella pullorum)적최소억균농도(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)분별위1.56 μg/mL、3.12 μg/mL화1.56 μg/mL.
