重庆医科大学学报
重慶醫科大學學報
중경의과대학학보
UNIVERSITATIS SCIENTIAE MEDICINAE CHONGQING
2011年
1期
64-67
,共4页
贾庆华%哈小琴%吕同德%刘春杰
賈慶華%哈小琴%呂同德%劉春傑
가경화%합소금%려동덕%류춘걸
角化细胞生长因子%腺病毒%构建%表达
角化細胞生長因子%腺病毒%構建%錶達
각화세포생장인자%선병독%구건%표체
目的:构建携带角化细胞生长因子(Kemtinocyte growth factor,KGF)的腺病毒载体并观察其在细胞中的表达.方法:通过PCR从pcDNA3-KGFpIRES2-EGFP-KGF质粒中扩增出目的片段KGF,定向克隆至穿梭质粒载体pShuttle-CMV中,构建pShuttl-KGF.经酶切及测序鉴定后,再将KGF定向克隆至重组腺病毒骨架载体pAdxsi,构建携带KGF的重组腺病毒载体(pAdxsi-GFP-KGF).酶切鉴定正确后,转染人胚肾细胞系HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、生产及纯化,半数组织感染量法(50%tissue cuIture infective dose,TCID50)测定重组腺病毒滴度.用重组腺病毒及空病毒Ad-null(作为阴性对照)转染人肺腺癌细胞A549,荧光显微镜下观察细胞绿色荧光蛋白的表达,ELISA鉴定KGF的表达.结果:成功构建了携带KGF的重组腺病毒,纯化后病毒滴度达1.6×10mpfu/ml.Ad-KGF转染A549细胞后24h在荧光显微镜下即可观察到绿色荧光蛋白,48 h表达更强,ELISA实验证实细胞表达KGF.结论:成功构建了携带KGF的重组腺病毒,为下一步研究KGF用于肺纤维化治疗研究奠定了实验基础.
目的:構建攜帶角化細胞生長因子(Kemtinocyte growth factor,KGF)的腺病毒載體併觀察其在細胞中的錶達.方法:通過PCR從pcDNA3-KGFpIRES2-EGFP-KGF質粒中擴增齣目的片段KGF,定嚮剋隆至穿梭質粒載體pShuttle-CMV中,構建pShuttl-KGF.經酶切及測序鑒定後,再將KGF定嚮剋隆至重組腺病毒骨架載體pAdxsi,構建攜帶KGF的重組腺病毒載體(pAdxsi-GFP-KGF).酶切鑒定正確後,轉染人胚腎細胞繫HEK293細胞,進行重組腺病毒的包裝、生產及純化,半數組織感染量法(50%tissue cuIture infective dose,TCID50)測定重組腺病毒滴度.用重組腺病毒及空病毒Ad-null(作為陰性對照)轉染人肺腺癌細胞A549,熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光蛋白的錶達,ELISA鑒定KGF的錶達.結果:成功構建瞭攜帶KGF的重組腺病毒,純化後病毒滴度達1.6×10mpfu/ml.Ad-KGF轉染A549細胞後24h在熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光蛋白,48 h錶達更彊,ELISA實驗證實細胞錶達KGF.結論:成功構建瞭攜帶KGF的重組腺病毒,為下一步研究KGF用于肺纖維化治療研究奠定瞭實驗基礎.
목적:구건휴대각화세포생장인자(Kemtinocyte growth factor,KGF)적선병독재체병관찰기재세포중적표체.방법:통과PCR종pcDNA3-KGFpIRES2-EGFP-KGF질립중확증출목적편단KGF,정향극륭지천사질립재체pShuttle-CMV중,구건pShuttl-KGF.경매절급측서감정후,재장KGF정향극륭지중조선병독골가재체pAdxsi,구건휴대KGF적중조선병독재체(pAdxsi-GFP-KGF).매절감정정학후,전염인배신세포계HEK293세포,진행중조선병독적포장、생산급순화,반수조직감염량법(50%tissue cuIture infective dose,TCID50)측정중조선병독적도.용중조선병독급공병독Ad-null(작위음성대조)전염인폐선암세포A549,형광현미경하관찰세포록색형광단백적표체,ELISA감정KGF적표체.결과:성공구건료휴대KGF적중조선병독,순화후병독적도체1.6×10mpfu/ml.Ad-KGF전염A549세포후24h재형광현미경하즉가관찰도록색형광단백,48 h표체경강,ELISA실험증실세포표체KGF.결론:성공구건료휴대KGF적중조선병독,위하일보연구KGF용우폐섬유화치료연구전정료실험기출.
