生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2007年
3期
440-445
,共6页
程安春%于小娜%汪铭书%朱德康%李玲%孙磊%陈孝跃
程安春%于小娜%汪銘書%硃德康%李玲%孫磊%陳孝躍
정안춘%우소나%왕명서%주덕강%리령%손뢰%진효약
鸭大肠杆菌%Ⅰ型菌毛.pilA基因%原核表达%免疫原性
鴨大腸桿菌%Ⅰ型菌毛.pilA基因%原覈錶達%免疫原性
압대장간균%Ⅰ형균모.pilA기인%원핵표체%면역원성
根据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列.用OLIGO6.0设计PCR引物,从鸭源致病性大肠杆菌GH1.2中扩增到pilA基因并将其克隆至pMD18-T栽体,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将鸭源致病性大肠杆菌pilA基因正向插入原核表达载体pET-32a(+)的Bam H I和Hindm位点间,成功构建了重组表达质粒pET-32a-pilA.重组表达质粒pET-32a-pilA转化表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导,表达出了大小约为36kD的pilA重组蛋白.表达产物用镍柱亲和层析纯化,与等量弗氏佐刺混合制备pilA重组蛋白疫苗,分别在1日龄、8日龄时两次对雏鸭进行免疫,二免后2周测定鸭血清中的ELISA抗体效价,并以109PFu同源菌株GH1.2攻毒,根据攻毒后鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变等级来判定pilA重组蛋白的免疫保护效果.结果pilA重组蛋白免疫鸭的血清中ELISA抗体效价为1:12800,全菌灭活苗免疫组的血清ELISA抗体效价为1:200;同源菌株攻毒后,pilA重组蛋白免疫保护组鸭的死亡率、E.coli分离率和各组织器官的病变程度均比攻毒对照组下降且差异显著或极显著,与全菌灭活苗免组比较差异不显著.表明piLA重组蛋白对同源菌株GH1.2的感染具有一定的保护效果.
根據GenBank中人源大腸桿菌pilA基因序列.用OLIGO6.0設計PCR引物,從鴨源緻病性大腸桿菌GH1.2中擴增到pilA基因併將其剋隆至pMD18-T栽體,經PCR、酶切和DNA測序鑒定後,將鴨源緻病性大腸桿菌pilA基因正嚮插入原覈錶達載體pET-32a(+)的Bam H I和Hindm位點間,成功構建瞭重組錶達質粒pET-32a-pilA.重組錶達質粒pET-32a-pilA轉化錶達宿主菌BL21(DE3),用IPTG誘導,錶達齣瞭大小約為36kD的pilA重組蛋白.錶達產物用鎳柱親和層析純化,與等量弗氏佐刺混閤製備pilA重組蛋白疫苗,分彆在1日齡、8日齡時兩次對雛鴨進行免疫,二免後2週測定鴨血清中的ELISA抗體效價,併以109PFu同源菌株GH1.2攻毒,根據攻毒後鴨的死亡率、E.coli分離率和各組織器官的病變等級來判定pilA重組蛋白的免疫保護效果.結果pilA重組蛋白免疫鴨的血清中ELISA抗體效價為1:12800,全菌滅活苗免疫組的血清ELISA抗體效價為1:200;同源菌株攻毒後,pilA重組蛋白免疫保護組鴨的死亡率、E.coli分離率和各組織器官的病變程度均比攻毒對照組下降且差異顯著或極顯著,與全菌滅活苗免組比較差異不顯著.錶明piLA重組蛋白對同源菌株GH1.2的感染具有一定的保護效果.
근거GenBank중인원대장간균pilA기인서렬.용OLIGO6.0설계PCR인물,종압원치병성대장간균GH1.2중확증도pilA기인병장기극륭지pMD18-T재체,경PCR、매절화DNA측서감정후,장압원치병성대장간균pilA기인정향삽입원핵표체재체pET-32a(+)적Bam H I화Hindm위점간,성공구건료중조표체질립pET-32a-pilA.중조표체질립pET-32a-pilA전화표체숙주균BL21(DE3),용IPTG유도,표체출료대소약위36kD적pilA중조단백.표체산물용얼주친화층석순화,여등량불씨좌자혼합제비pilA중조단백역묘,분별재1일령、8일령시량차대추압진행면역,이면후2주측정압혈청중적ELISA항체효개,병이109PFu동원균주GH1.2공독,근거공독후압적사망솔、E.coli분리솔화각조직기관적병변등급래판정pilA중조단백적면역보호효과.결과pilA중조단백면역압적혈청중ELISA항체효개위1:12800,전균멸활묘면역조적혈청ELISA항체효개위1:200;동원균주공독후,pilA중조단백면역보호조압적사망솔、E.coli분리솔화각조직기관적병변정도균비공독대조조하강차차이현저혹겁현저,여전균멸활묘면조비교차이불현저.표명piLA중조단백대동원균주GH1.2적감염구유일정적보호효과.
