CAJ | 학술논문

构建大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt及表达与鉴定目的蛋白,为进一步利用该酶催化合成茶氨酸等目的产物奠定了基础.以大肠杆菌DH5α总DNA为模板,用PCR法在γ-ggt编码序列上下游引入酶切位点并扩增出γ-谷氨酰转肽酶基因;将γ-ggt编码序列克隆入原核表达载体pGEX-4T-1的相应酶切位点;用PCR鉴定重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt,并对插入基因片断测序;重组质粒pGEX-4T-1/γ-ggt转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导后用SDS-PAGE分析表达产物,并经Western blot鉴定.获得大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶基因,并成功构建到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化有pGEX-4T-1/γ-ggt工程菌BL21(DE3)经1 g/L乳糖诱导1 h后即开始表达目的蛋白,在诱导6 h后表达蛋白量达到最高,随着时间的延长,目的蛋白没有被降解,此蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot鉴定了此目的蛋白.成功构建了大肠杆菌γ-谷氨酰转肽酶原核表达载体pGEX-4T-1/γ-ggt,并进行了目的蛋白的鉴定.
구건대장간균γ-곡안선전태매원핵표체재체pGEX-4T-1/γ-ggt급표체여감정목적단백,위진일보이용해매최화합성다안산등목적산물전정료기출.이대장간균DH5α총DNA위모판,용PCR법재γ-ggt편마서렬상하유인입매절위점병확증출γ-곡안선전태매기인;장γ-ggt편마서렬극륭입원핵표체재체pGEX-4T-1적상응매절위점;용PCR감정중조질립pGEX-4T-1/γ-ggt,병대삽입기인편단측서;중조질립pGEX-4T-1/γ-ggt전화대장간균BL21(DE3),경유당유도후용SDS-PAGE분석표체산물,병경Western blot감정.획득대장간균γ-곡안선전태매기인,병성공구건도원핵표체재체pGEX-4T-1상,전화유pGEX-4T-1/γ-ggt공정균BL21(DE3)경1 g/L유당유도1 h후즉개시표체목적단백,재유도6 h후표체단백량체도최고,수착시간적연장,목적단백몰유피강해,차단백주요이포함체형식존재,Western blot감정료차목적단백.성공구건료대장간균γ-곡안선전태매원핵표체재체pGEX-4T-1/γ-ggt,병진행료목적단백적감정.