南方医科大学学报
南方醫科大學學報
남방의과대학학보
JOURNAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY
2010年
7期
1496-1500
,共5页
登革病毒%E蛋白%原核表达
登革病毒%E蛋白%原覈錶達
등혁병독%E단백%원핵표체
目的 在大肠杆菌中表达登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三结构域(DⅢ),并进行纯化及免疫反应性鉴定.方法 登革Ⅱ型病毒接种乳鼠,提取总RNA,经RT-PCR扩增E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E载体.以pMD18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增E蛋白DⅢ基因片段并纯化.用限制性内切酶双酶切纯化产物和表达质粒pET-32a(+)并连接构建重组质粒.筛选的阳性质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,表达蛋白经SDS-PAGE分析和Ni-NTA树脂纯化,Western blot鉴定.结果 RT-PCR扩增获得1.5 kb的E蛋白全长基因片段,构建pMD 18-T-DV2-E质粒;以pMD 18-T-DV2-E质粒为模板,PCR扩增获得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,构建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ表达质粒;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析,表达相对分子质量约为29000的可溶性重组蛋白,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的52.50%:Western blot鉴定显示重组蛋白与His·Tag单抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗均发生反应.结论 重组质粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大肠杆菌中可溶性表达登革Ⅱ型病毒E蛋白第三结构域,重组蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)单抗识别.
目的 在大腸桿菌中錶達登革Ⅱ型病毒包膜糖蛋白(E)的第三結構域(DⅢ),併進行純化及免疫反應性鑒定.方法 登革Ⅱ型病毒接種乳鼠,提取總RNA,經RT-PCR擴增E蛋白全長基因片段,構建pMD 18-T-DV2-E載體.以pMD18-T-DV2-E質粒為模闆,PCR擴增E蛋白DⅢ基因片段併純化.用限製性內切酶雙酶切純化產物和錶達質粒pET-32a(+)併連接構建重組質粒.篩選的暘性質粒轉化至E.coli BL21(DE3)感受態細胞,IPTG誘導錶達,錶達蛋白經SDS-PAGE分析和Ni-NTA樹脂純化,Western blot鑒定.結果 RT-PCR擴增穫得1.5 kb的E蛋白全長基因片段,構建pMD 18-T-DV2-E質粒;以pMD 18-T-DV2-E質粒為模闆,PCR擴增穫得320 bp的E蛋白DⅢ基因片段,構建pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ錶達質粒;IPTG誘導後經SDS-PAGE分析,錶達相對分子質量約為29000的可溶性重組蛋白,其錶達量佔細菌裂解液中總蛋白量的52.50%:Western blot鑒定顯示重組蛋白與His·Tag單抗和登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)單抗均髮生反應.結論 重組質粒pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ在大腸桿菌中可溶性錶達登革Ⅱ型病毒E蛋白第三結構域,重組蛋白能被登革病毒(Ⅰ-Ⅳ)單抗識彆.
목적 재대장간균중표체등혁Ⅱ형병독포막당단백(E)적제삼결구역(DⅢ),병진행순화급면역반응성감정.방법 등혁Ⅱ형병독접충유서,제취총RNA,경RT-PCR확증E단백전장기인편단,구건pMD 18-T-DV2-E재체.이pMD18-T-DV2-E질립위모판,PCR확증E단백DⅢ기인편단병순화.용한제성내절매쌍매절순화산물화표체질립pET-32a(+)병련접구건중조질립.사선적양성질립전화지E.coli BL21(DE3)감수태세포,IPTG유도표체,표체단백경SDS-PAGE분석화Ni-NTA수지순화,Western blot감정.결과 RT-PCR확증획득1.5 kb적E단백전장기인편단,구건pMD 18-T-DV2-E질립;이pMD 18-T-DV2-E질립위모판,PCR확증획득320 bp적E단백DⅢ기인편단,구건pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ표체질립;IPTG유도후경SDS-PAGE분석,표체상대분자질량약위29000적가용성중조단백,기표체량점세균렬해액중총단백량적52.50%:Western blot감정현시중조단백여His·Tag단항화등혁병독(Ⅰ-Ⅳ)단항균발생반응.결론 중조질립pET-32a(+)-DV2-E-DⅢ재대장간균중가용성표체등혁Ⅱ형병독E단백제삼결구역,중조단백능피등혁병독(Ⅰ-Ⅳ)단항식별.
