江西医学院学报
江西醫學院學報
강서의학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE JIANGXI
2009年
2期
22-25
,共4页
逆转录病毒%RNA干扰%P53
逆轉錄病毒%RNA榦擾%P53
역전록병독%RNA간우%P53
目的 构建逆转录病毒Pmscv/Hyg介导的RNA干扰表达载体,并在HEK293细胞株中观察其基因沉默效果.方法 PCR方法扩增人U6启动子,下游引入核酸内切酶位点BamHI、SalI,反向插入质粒Pmscv/Hyg的3′端LTR上游.扩增EGFP基因,插入载体Pmscv/Hyg的多克隆位点.合成干扰P53基因表达的寡核苷酸序列,退火复性后插入U6启动子下游BamHI、SalI酶切位点间.重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转染病毒包装细胞PT67,产生具有一次感染能力的病毒颗粒.病毒上清感染靶细胞HEK293,经潮霉素筛选,RT-PCR和western blot检测靶基因P53表达情况.结果 质粒酶切及DNA测序表明成功构建重组病毒载体,并在PT67细胞中包装成具有一次感染能力的逆转录病毒.经Hygromycin筛选,HEK293细胞中P53蛋白和mRNA表达显著下调.结论 成功构建以Pmscv/Hyg为基础的RNA干扰表达载体,重组载体包装出的逆转录病毒可有效介导基因沉默.
目的 構建逆轉錄病毒Pmscv/Hyg介導的RNA榦擾錶達載體,併在HEK293細胞株中觀察其基因沉默效果.方法 PCR方法擴增人U6啟動子,下遊引入覈痠內切酶位點BamHI、SalI,反嚮插入質粒Pmscv/Hyg的3′耑LTR上遊.擴增EGFP基因,插入載體Pmscv/Hyg的多剋隆位點.閤成榦擾P53基因錶達的寡覈苷痠序列,退火複性後插入U6啟動子下遊BamHI、SalI酶切位點間.重組質粒經酶切、測序鑒定正確後轉染病毒包裝細胞PT67,產生具有一次感染能力的病毒顆粒.病毒上清感染靶細胞HEK293,經潮黴素篩選,RT-PCR和western blot檢測靶基因P53錶達情況.結果 質粒酶切及DNA測序錶明成功構建重組病毒載體,併在PT67細胞中包裝成具有一次感染能力的逆轉錄病毒.經Hygromycin篩選,HEK293細胞中P53蛋白和mRNA錶達顯著下調.結論 成功構建以Pmscv/Hyg為基礎的RNA榦擾錶達載體,重組載體包裝齣的逆轉錄病毒可有效介導基因沉默.
목적 구건역전록병독Pmscv/Hyg개도적RNA간우표체재체,병재HEK293세포주중관찰기기인침묵효과.방법 PCR방법확증인U6계동자,하유인입핵산내절매위점BamHI、SalI,반향삽입질립Pmscv/Hyg적3′단LTR상유.확증EGFP기인,삽입재체Pmscv/Hyg적다극륭위점.합성간우P53기인표체적과핵감산서렬,퇴화복성후삽입U6계동자하유BamHI、SalI매절위점간.중조질립경매절、측서감정정학후전염병독포장세포PT67,산생구유일차감염능력적병독과립.병독상청감염파세포HEK293,경조매소사선,RT-PCR화western blot검측파기인P53표체정황.결과 질립매절급DNA측서표명성공구건중조병독재체,병재PT67세포중포장성구유일차감염능력적역전록병독.경Hygromycin사선,HEK293세포중P53단백화mRNA표체현저하조.결론 성공구건이Pmscv/Hyg위기출적RNA간우표체재체,중조재체포장출적역전록병독가유효개도기인침묵.
