CAJ | 학술논문

为了观察热量限制对主动脉内皮细胞中HNF3γ及NOX4 基因表达的影响,揭示HNF3γ-NOX4-活性氧通路介导热量限制抗内皮细胞衰老的分子机制,文章将主动脉内皮细胞分为5 组:对照组、高热量组、低热量组、siRNA+ 低热量组、siRNA+ 高热量组.应用逆转录实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 、Western blotting 分析各组HNF3γ、NOX4 mRNA 及蛋白水平变化,并检测各组细胞内活性氧产量及细胞衰老程度变化.采用染色质免疫共沉淀分析HNF3γ蛋白与NOX4 基因启动子区域结合情况,萤光素酶报告基因检测HNF3γ蛋白结合后对NOX4 基因启动子活性的影响.结果显示:与对照组比较,低热量组HNF3γ mRNA 和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著升高(P<0.05),NOX4 mRNA 和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著降低(P<0.05); 高热量组HNF3γ mRNA 和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著降低(P<0.05),NOX4 mRNA 和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著升高(P<0.05); siRNA+ 低热量组及siRNA+ 高热量组中NOX4 mRNA 和蛋白表达水平、细胞内活性氧水平及细胞衰老程度显著升高(P< 0.05).染色质免疫共沉淀证实HNF3γ蛋白可与NOX4 基因启动区域4 个结合位点(.6 bp 、.76 bp 、.249 bp 、.954 bp) 结合.萤光素酶报告基因检测显示HNF3γ蛋白与NOX4 启动子区域1 个位点(.6 bp)、2 个位点(.6、.76 bp) 、3 个位点(.6、.76、.249 bp) 、4 个位点(.6、.76、.249 、.954 bp) 结合,可使NOX4 启动子活性分别降低至对照组的80.15±4.64% 、40.02.±2.15% 、16.46±2.24% 、12.13±1.46%,P<0.05.上述结果提示热量限制可上调HNF3γ基因表达,增强HNF3γ蛋白活性,促进HNF3γ蛋白同NOX4 基因启动子区域结合,抑制NOX4 基因表达,进而减少细胞内活性氧产生而延缓动脉内皮细胞衰老.
위료관찰열량한제대주동맥내피세포중HNF3γ급NOX4 기인표체적영향,게시HNF3γ-NOX4-활성양통로개도열량한제항내피세포쇠로적분자궤제,문장장주동맥내피세포분위5 조:대조조、고열량조、저열량조、siRNA+ 저열량조、siRNA+ 고열량조.응용역전록실시정량PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR) 、Western blotting 분석각조HNF3γ、NOX4 mRNA 급단백수평변화,병검측각조세포내활성양산량급세포쇠로정도변화.채용염색질면역공침정분석HNF3γ단백여NOX4 기인계동자구역결합정황,형광소매보고기인검측HNF3γ단백결합후대NOX4 기인계동자활성적영향.결과현시:여대조조비교,저열량조HNF3γ mRNA 화총HNF3γ단백표체수평、린산화/총HNF3γ비치현저승고(P<0.05),NOX4 mRNA 화단백표체수평、세포내활성양산량급세포쇠로정도현저강저(P<0.05); 고열량조HNF3γ mRNA 화총HNF3γ단백표체수평、린산화/총HNF3γ비치현저강저(P<0.05),NOX4 mRNA 화단백표체수평、세포내활성양산량급세포쇠로정도현저승고(P<0.05); siRNA+ 저열량조급siRNA+ 고열량조중NOX4 mRNA 화단백표체수평、세포내활성양수평급세포쇠로정도현저승고(P< 0.05).염색질면역공침정증실HNF3γ단백가여NOX4 기인계동구역4 개결합위점(.6 bp 、.76 bp 、.249 bp 、.954 bp) 결합.형광소매보고기인검측현시HNF3γ단백여NOX4 계동자구역1 개위점(.6 bp)、2 개위점(.6、.76 bp) 、3 개위점(.6、.76、.249 bp) 、4 개위점(.6、.76、.249 、.954 bp) 결합,가사NOX4 계동자활성분별강저지대조조적80.15±4.64% 、40.02.±2.15% 、16.46±2.24% 、12.13±1.46%,P<0.05.상술결과제시열량한제가상조HNF3γ기인표체,증강HNF3γ단백활성,촉진HNF3γ단백동NOX4 기인계동자구역결합,억제NOX4 기인표체,진이감소세포내활성양산생이연완동맥내피세포쇠로.