中国修复重建外科杂志
中國脩複重建外科雜誌
중국수복중건외과잡지
CHINESE JOURNAL OF REPARATIVE AND RECONSTRUCTIVE SURGERY
2008年
5期
533-538
,共6页
芮云峰%王友%张晓玲%孙红立%曲志虎%戴尅戎
芮雲峰%王友%張曉玲%孫紅立%麯誌虎%戴尅戎
예운봉%왕우%장효령%손홍립%곡지호%대극융
IL-1受体拮抗蛋白%逆转录病毒载体%骨关节炎%软骨细胞%基因治疗
IL-1受體拮抗蛋白%逆轉錄病毒載體%骨關節炎%軟骨細胞%基因治療
IL-1수체길항단백%역전록병독재체%골관절염%연골세포%기인치료
目的 构建含人IL-1受体拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆转录病毒表达载体(PLXRN-IL-1Ra),体外转染人骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨细胞,研究其相关特性.方法 利用细菌内同源重组技术快速构建PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒重组质粒,经测序及酶切鉴定正确后转染PT67细胞,包装成为重组PLXRN-IL-1Ra逆转录病毒,并使用小鼠肾成纤维细胞系NIH/3T3对病毒进行滴度测定.实验分为3组:未转染组(A组)、PLXRN空质粒转染组(B组)、PLXRN-IL-1Ra转染组(C组),病毒感染人OA软骨细胞后,RT-PCR检测细胞内IL-1Ra基因的转录和表达;ELISA法检测细胞培养上清液中人IL-1Ra蛋白表达.结果 酶切鉴定及基因测序证实重组逆转录病毒质粒中含有人IL-1Ra cDNA,测定包装的病毒滴度为3 × 104 CFU/mL.原代软骨细胞体外培养呈多角形或梭形,甲苯胺蓝染色见细胞内有紫色异染颗粒.RT-PCR结果显示在C组出现311 bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B组未见人IL-1Ra mRNA的表达带,GAPDH在各组均有表达.ELISA检测发现C组细胞上清有一定量的人IL-1Ra表达,蛋白浓度为(60.47±15.13)ng/L,A组和B组均无人IL-1Ra表达.结论 构建的IL-1Ra逆转录病毒表达载体成功地感染人OA软骨细胞,并在体外获得稳定表达,为将表达人IL-1Ra基因的人OA软骨细胞用于OA基因治疗提供了实验依据.
目的 構建含人IL-1受體拮抗蛋白(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)逆轉錄病毒錶達載體(PLXRN-IL-1Ra),體外轉染人骨關節炎(osteoarthritis, OA)軟骨細胞,研究其相關特性.方法 利用細菌內同源重組技術快速構建PLXRN-IL-1Ra逆轉錄病毒重組質粒,經測序及酶切鑒定正確後轉染PT67細胞,包裝成為重組PLXRN-IL-1Ra逆轉錄病毒,併使用小鼠腎成纖維細胞繫NIH/3T3對病毒進行滴度測定.實驗分為3組:未轉染組(A組)、PLXRN空質粒轉染組(B組)、PLXRN-IL-1Ra轉染組(C組),病毒感染人OA軟骨細胞後,RT-PCR檢測細胞內IL-1Ra基因的轉錄和錶達;ELISA法檢測細胞培養上清液中人IL-1Ra蛋白錶達.結果 酶切鑒定及基因測序證實重組逆轉錄病毒質粒中含有人IL-1Ra cDNA,測定包裝的病毒滴度為3 × 104 CFU/mL.原代軟骨細胞體外培養呈多角形或梭形,甲苯胺藍染色見細胞內有紫色異染顆粒.RT-PCR結果顯示在C組齣現311 bp人IL-1Ra mRNA片段,A、B組未見人IL-1Ra mRNA的錶達帶,GAPDH在各組均有錶達.ELISA檢測髮現C組細胞上清有一定量的人IL-1Ra錶達,蛋白濃度為(60.47±15.13)ng/L,A組和B組均無人IL-1Ra錶達.結論 構建的IL-1Ra逆轉錄病毒錶達載體成功地感染人OA軟骨細胞,併在體外穫得穩定錶達,為將錶達人IL-1Ra基因的人OA軟骨細胞用于OA基因治療提供瞭實驗依據.
목적 구건함인IL-1수체길항단백(IL-1 receptor antagonist, IL-1Ra)역전록병독표체재체(PLXRN-IL-1Ra),체외전염인골관절염(osteoarthritis, OA)연골세포,연구기상관특성.방법 이용세균내동원중조기술쾌속구건PLXRN-IL-1Ra역전록병독중조질립,경측서급매절감정정학후전염PT67세포,포장성위중조PLXRN-IL-1Ra역전록병독,병사용소서신성섬유세포계NIH/3T3대병독진행적도측정.실험분위3조:미전염조(A조)、PLXRN공질립전염조(B조)、PLXRN-IL-1Ra전염조(C조),병독감염인OA연골세포후,RT-PCR검측세포내IL-1Ra기인적전록화표체;ELISA법검측세포배양상청액중인IL-1Ra단백표체.결과 매절감정급기인측서증실중조역전록병독질립중함유인IL-1Ra cDNA,측정포장적병독적도위3 × 104 CFU/mL.원대연골세포체외배양정다각형혹사형,갑분알람염색견세포내유자색이염과립.RT-PCR결과현시재C조출현311 bp인IL-1Ra mRNA편단,A、B조미견인IL-1Ra mRNA적표체대,GAPDH재각조균유표체.ELISA검측발현C조세포상청유일정량적인IL-1Ra표체,단백농도위(60.47±15.13)ng/L,A조화B조균무인IL-1Ra표체.결론 구건적IL-1Ra역전록병독표체재체성공지감염인OA연골세포,병재체외획득은정표체,위장표체인IL-1Ra기인적인OA연골세포용우OA기인치료제공료실험의거.
