CAJ | 학술논문

背景:RNA干扰已被多次证实足一种特异、高效、经济的使基因表达受抑的技术手段.目的:以短发卡RNA腺病毒表达载体为介导,构建介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒.设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-09在环境与疾病相关基因教育部重点实验室完成.材料:人骨肉瘤细胞系OS-9901由解放军第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所范清宇教授惠赠.方法:设计有短发夹RNA结构的3对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,通过反转录-聚合酶链反应方法筛选对c-myc沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒.主要观察指标:①观察细胞病变效应.②通过50%组织培养感染剂量测定病毒滴度.结果:电泳验证后的dsoligo插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确.对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经Pac Ⅰ酶切线性化后同源重组后成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒.3 d开始出现细胞病变效心,6d更加明显,测定证实病毒滴度为103.8/0.1 mL.结论:成功构建介导shRNA.c-myc复制缺陷型重组腺病毒.
배경:RNA간우이피다차증실족일충특이、고효、경제적사기인표체수억적기술수단.목적:이단발잡RNA선병독표체재체위개도,구건개도shRNA-c-myc복제결함형중조선병독.설계、시간급지점:단일양본관찰,우2006-09/2007-09재배경여질병상관기인교육부중점실험실완성.재료:인골육류세포계OS-9901유해방군제사군의대학당도의원전군골종류연구소범청우교수혜증.방법:설계유단발협RNA결구적3대단련과핵감산(ss oligo),경변성퇴화위쌍련과핵감산(ds oligo)삽입천사질립pENTR/U6재체,측서정학후경양리자지질체개도입인골육류세포계OS-9901,통과반전록-취합매련반응방법사선대c-myc침묵효과최가천사질립pENTR/U6-shRNA,연후여선병독골가질립행동원중조,사선출정학중조자,용293A세포포장출표체c-myc-shRNA적복제결함형중조선병독.주요관찰지표:①관찰세포병변효응.②통과50%조직배양감염제량측정병독적도.결과:전영험증후적dsoligo삽입천사질립pENTR/U6재체,측서결과제시소구건적pENTR/U6-shRNA질립정학.대c-myc침묵효과최가적천사질립pENTR/U6-shRNA,경Pac Ⅰ매절선성화후동원중조후성공구건료개도c-myc-shRNA복제결함형중조선병독.3 d개시출현세포병변효심,6d경가명현,측정증실병독적도위103.8/0.1 mL.결론:성공구건개도shRNA.c-myc복제결함형중조선병독.