第四军医大学学报
第四軍醫大學學報
제사군의대학학보
JOURNAL OF THE FOURTH MILITARY MEDICAL UNIVERSITY
2007年
9期
769-772
,共4页
任婷婷%刘新平%车红磊%张健%张璟%李霞%苏金
任婷婷%劉新平%車紅磊%張健%張璟%李霞%囌金
임정정%류신평%차홍뢰%장건%장경%리하%소금
DDR2%聚合酶链式反应%分子%克隆%基因表达%免疫荧光
DDR2%聚閤酶鏈式反應%分子%剋隆%基因錶達%免疫熒光
DDR2%취합매련식반응%분자%극륭%기인표체%면역형광
目的:构建带有flag标签的人DDR2 pShuttle-CMV载体, 检测其真核表达并观察DDR2分子的亚细胞分布. 方法:以含有人全长DDR2 cDNA的质粒为模板,用PCR方法扩增DDR2基因的C-端(DDR2-C),并在其C末端带上含24 bp的flag标签,Nco I/EcoR V酶切后亚克隆入含有DDR2全长序列的pMD18-T载体,即替换掉原有DDR2序列的C-端,引入flag标签,测序正确后再克隆入pShuttle-CMV表达载体,酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染HEK293细胞,Western Blot检测DDR2-flag在细胞中的表达. 瞬时转染Hela细胞,通过间接免疫荧光法观察DDR2分子在细胞内的分布情况. 结果:测序及酶切显示DDR2-flag/pShuttle-CMV载体构建符合预期;脂质体法转染HEK293细胞,24 h后用Western Blot方法检测到目的蛋白的表达;对转染了目的载体的细胞应用FITC标记的抗体进行间接免疫荧光实验,激光共聚焦显微镜观察到DDR2分子主要分布于细胞质与细胞膜. 结论:成功构建并表达了C-末端带flag标签的DDR2真核表达载体,使其在真核细胞中表达,并观察到其亚细胞分布.
目的:構建帶有flag標籤的人DDR2 pShuttle-CMV載體, 檢測其真覈錶達併觀察DDR2分子的亞細胞分佈. 方法:以含有人全長DDR2 cDNA的質粒為模闆,用PCR方法擴增DDR2基因的C-耑(DDR2-C),併在其C末耑帶上含24 bp的flag標籤,Nco I/EcoR V酶切後亞剋隆入含有DDR2全長序列的pMD18-T載體,即替換掉原有DDR2序列的C-耑,引入flag標籤,測序正確後再剋隆入pShuttle-CMV錶達載體,酶切鑒定正確後採用脂質體法瞬時轉染HEK293細胞,Western Blot檢測DDR2-flag在細胞中的錶達. 瞬時轉染Hela細胞,通過間接免疫熒光法觀察DDR2分子在細胞內的分佈情況. 結果:測序及酶切顯示DDR2-flag/pShuttle-CMV載體構建符閤預期;脂質體法轉染HEK293細胞,24 h後用Western Blot方法檢測到目的蛋白的錶達;對轉染瞭目的載體的細胞應用FITC標記的抗體進行間接免疫熒光實驗,激光共聚焦顯微鏡觀察到DDR2分子主要分佈于細胞質與細胞膜. 結論:成功構建併錶達瞭C-末耑帶flag標籤的DDR2真覈錶達載體,使其在真覈細胞中錶達,併觀察到其亞細胞分佈.
목적:구건대유flag표첨적인DDR2 pShuttle-CMV재체, 검측기진핵표체병관찰DDR2분자적아세포분포. 방법:이함유인전장DDR2 cDNA적질립위모판,용PCR방법확증DDR2기인적C-단(DDR2-C),병재기C말단대상함24 bp적flag표첨,Nco I/EcoR V매절후아극륭입함유DDR2전장서렬적pMD18-T재체,즉체환도원유DDR2서렬적C-단,인입flag표첨,측서정학후재극륭입pShuttle-CMV표체재체,매절감정정학후채용지질체법순시전염HEK293세포,Western Blot검측DDR2-flag재세포중적표체. 순시전염Hela세포,통과간접면역형광법관찰DDR2분자재세포내적분포정황. 결과:측서급매절현시DDR2-flag/pShuttle-CMV재체구건부합예기;지질체법전염HEK293세포,24 h후용Western Blot방법검측도목적단백적표체;대전염료목적재체적세포응용FITC표기적항체진행간접면역형광실험,격광공취초현미경관찰도DDR2분자주요분포우세포질여세포막. 결론:성공구건병표체료C-말단대flag표첨적DDR2진핵표체재체,사기재진핵세포중표체,병관찰도기아세포분포.
