定点突变巴曲酶在毕赤酵母中的克隆与表达
정점돌변파곡매재필적효모중적극륭여표체
Cloning and Expression of mutant Batroxobin,a Thrombin-like Enzyme,in Pichia pastoris by Overlap Extension PCR
  • 万方数据
    蛇志 사지
    JOURNAL OF SNAKE
    2011年 2期 105-110 ,共6页

    王宏英%徐梅%兰海英%杨宇%张宏杰%李娜%薛雁%薛百忠

    왕굉영%서매%란해영%양우%장굉걸%리나%설안%설백충

    突变巴曲酶%类凝血酶%巴斯德毕赤酵母%克隆和表达%偏好密码子%套叠PCR 突變巴麯酶%類凝血酶%巴斯德畢赤酵母%剋隆和錶達%偏好密碼子%套疊PCR
    돌변파곡매%류응혈매%파사덕필적효모%극륭화표체%편호밀마자%투첩PCR
    目的 为避免毕赤酵母分泌的Kex2蛋白酶对发酵液中所表达的巴曲酶的降解.利用重叠PCR方法对巴曲酶基因进行定点突变,将巴曲酶基因第45位的Arg突变为Lys.方法 将突变后的基因克隆到酵母分泌型表达载体pPICZαA中,将重组载体酶切线性化后经电转化转入巴斯德毕赤酵母细胞,筛选鉴定转化子,经摇瓶发酵甲醇诱导,酵母菌分泌表达有凝血活性的定点突变巴曲酶,经SDS-PAG电泳、免疫印迹确定其分子量为32 kD.结果发酵罐的表达量达到52 KU/ml发酵液,较重组天然巴曲酶的表达量提高了73.3%.结论 定点突变巴曲酶的表达量比重组天然巴曲酶的表达量有显著提高,表达的突变巴曲酶同样具有凝血活性.
    목적 위피면필적효모분비적Kex2단백매대발효액중소표체적파곡매적강해.이용중첩PCR방법대파곡매기인진행정점돌변,장파곡매기인제45위적Arg돌변위Lys.방법 장돌변후적기인극륭도효모분비형표체재체pPICZαA중,장중조재체매절선성화후경전전화전입파사덕필적효모세포,사선감정전화자,경요병발효갑순유도,효모균분비표체유응혈활성적정점돌변파곡매,경SDS-PAG전영、면역인적학정기분자량위32 kD.결과발효관적표체량체도52 KU/ml발효액,교중조천연파곡매적표체량제고료73.3%.결론 정점돌변파곡매적표체량비중조천연파곡매적표체량유현저제고,표체적돌변파곡매동양구유응혈활성.
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