中华外科杂志
中華外科雜誌
중화외과잡지
CHINESE JOURNAL OF SURGERY
2007年
18期
1279-1283
,共5页
康焱%廖威明%盛璞义%张珑涓%原向伟%雷磊%黄保丁
康焱%廖威明%盛璞義%張瓏涓%原嚮偉%雷磊%黃保丁
강염%료위명%성박의%장롱연%원향위%뢰뢰%황보정
骨髓祖代细胞%中胚层%人骨形成蛋白%腺相关病毒
骨髓祖代細胞%中胚層%人骨形成蛋白%腺相關病毒
골수조대세포%중배층%인골형성단백%선상관병독
目的 构建人骨形成蛋白7基因(hBMP7)重组腺相关病毒载体,并观察其在兔骨髓间充质干细胞中的表达.方法 将骨形成蛋白7基因片段克隆入穿梭质粒pUC18获得重组质粒pUC18-hBMP7.Kpn Ⅰ和Sa Ⅱ双酶切质粒pUC18-hBMP7与pSNAV,用T4DNA连接酶连接分别回收的两片段后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒PSNAV-hBMP7,转染BHK-21细胞,筛选培养,用能表达Rap和Cap的重组Ⅰ型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染此细胞,裂解细胞收获病毒液.采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提法分离浓缩、纯化与测定病毒滴度.用rAAV2-hBMP7和rAAV2-EGFP在体外分别转染兔骨髓间充质干细胞.流式细胞仪、RT-PCR和Western-blot方法检测兔骨髓间充质干细胞中hBMP-7基因的转录和表达.结果 成功构建具有感染活性的重组腺相关病毒载体rAAV2-hBMP7,病毒载体对兔骨髓间充质干细胞早期转染效率可达99.8%,hBMP7在兔骨髓间充质干细胞中可得到转录和表达.结论 成功构建了人骨形成蛋白7基因重组腺相关病毒载体,rAAV2-hBMP7载体在体外可转染兔骨髓间充质干细胞,并获得较高的转染效率.
目的 構建人骨形成蛋白7基因(hBMP7)重組腺相關病毒載體,併觀察其在兔骨髓間充質榦細胞中的錶達.方法 將骨形成蛋白7基因片段剋隆入穿梭質粒pUC18穫得重組質粒pUC18-hBMP7.Kpn Ⅰ和Sa Ⅱ雙酶切質粒pUC18-hBMP7與pSNAV,用T4DNA連接酶連接分彆迴收的兩片段後轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞,穫得重組質粒PSNAV-hBMP7,轉染BHK-21細胞,篩選培養,用能錶達Rap和Cap的重組Ⅰ型單純皰疹病毒HSV1-rc/△UL2感染此細胞,裂解細胞收穫病毒液.採用氯倣處理-PEG/NaCl沉澱-氯倣抽提法分離濃縮、純化與測定病毒滴度.用rAAV2-hBMP7和rAAV2-EGFP在體外分彆轉染兔骨髓間充質榦細胞.流式細胞儀、RT-PCR和Western-blot方法檢測兔骨髓間充質榦細胞中hBMP-7基因的轉錄和錶達.結果 成功構建具有感染活性的重組腺相關病毒載體rAAV2-hBMP7,病毒載體對兔骨髓間充質榦細胞早期轉染效率可達99.8%,hBMP7在兔骨髓間充質榦細胞中可得到轉錄和錶達.結論 成功構建瞭人骨形成蛋白7基因重組腺相關病毒載體,rAAV2-hBMP7載體在體外可轉染兔骨髓間充質榦細胞,併穫得較高的轉染效率.
목적 구건인골형성단백7기인(hBMP7)중조선상관병독재체,병관찰기재토골수간충질간세포중적표체.방법 장골형성단백7기인편단극륭입천사질립pUC18획득중조질립pUC18-hBMP7.Kpn Ⅰ화Sa Ⅱ쌍매절질립pUC18-hBMP7여pSNAV,용T4DNA련접매련접분별회수적량편단후전화대장간균DH5α감수태세포,획득중조질립PSNAV-hBMP7,전염BHK-21세포,사선배양,용능표체Rap화Cap적중조Ⅰ형단순포진병독HSV1-rc/△UL2감염차세포,렬해세포수획병독액.채용록방처리-PEG/NaCl침정-록방추제법분리농축、순화여측정병독적도.용rAAV2-hBMP7화rAAV2-EGFP재체외분별전염토골수간충질간세포.류식세포의、RT-PCR화Western-blot방법검측토골수간충질간세포중hBMP-7기인적전록화표체.결과 성공구건구유감염활성적중조선상관병독재체rAAV2-hBMP7,병독재체대토골수간충질간세포조기전염효솔가체99.8%,hBMP7재토골수간충질간세포중가득도전록화표체.결론 성공구건료인골형성단백7기인중조선상관병독재체,rAAV2-hBMP7재체재체외가전염토골수간충질간세포,병획득교고적전염효솔.
