CAJ | 학술논문

本研究目的是建立稳定表达HLA-A*1101分子的K562细胞株,为研究慢性髓系白血病(CML)HLA-I限制性抗原特异T细胞的细胞毒作用提供靶细胞.利用RT-PCR从CML患者外周血单个细胞中扩增HLA-A*1101基因全长序列；利用重组PCR将2A肽连接子(D-V-E-X-N-P-G-P)基因连接到HLA-A+ 1101的3’端,并将其定向克隆入带有增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N3,构成HLA-A+ 1101-T2A-EGFP转录盒的重组表达载体；利用电穿孔技术将pEGFP-N3或重组质粒转染入K562细胞,利用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的表达,通过G418筛选出有效转染pEGFP-N3或HLA-A* 1101 -T2A-EGFP载体的K 562细胞株；利用RT-PCR和流式细胞术检测HLA-A* 1101基因和蛋白的表述情况.结果表明,成功构建了以2A肽基因为连接子的HLA-A* 1101-T2A-EGFP真核表达载体；重组质粒转染的K562细胞经G418筛选2个月后,获得2株表达绿色荧光蛋白的K562稳定细胞株HLA-A* 1101 +K562和pEGFP-N3+ K562.RT-PCR检测证明,HLA-A* 1101+ K562细胞表达HLA-A* 1101基因,而pEGFP-N3+ K562细胞则不表达HLA-A*1101；流式细胞术分析显示,HLA-A* 1101和GFP蛋白双阳性HLA-A*1101+K562细胞占88.5％,明显高于pEGFP-N3+ K562细胞(0.698％).结论:建立了一个简单有效地筛选HLA-A+ 1101+ K562细胞株的方法,并成功地建立了膜稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株,为进一步研究CML的特异性细胞免疫提供工具细胞.
본연구목적시건립은정표체HLA-A*1101분자적K562세포주,위연구만성수계백혈병(CML)HLA-I한제성항원특이T세포적세포독작용제공파세포.이용RT-PCR종CML환자외주혈단개세포중확증HLA-A*1101기인전장서렬；이용중조PCR장2A태련접자(D-V-E-X-N-P-G-P)기인련접도HLA-A+ 1101적3’단,병장기정향극륭입대유증강형록색형광단백기인적진핵표체재체pEGFP-N3,구성HLA-A+ 1101-T2A-EGFP전록합적중조표체재체；이용전천공기술장pEGFP-N3혹중조질립전염입K562세포,이용형광현미경감측록색형광단백적표체,통과G418사선출유효전염pEGFP-N3혹HLA-A* 1101 -T2A-EGFP재체적K 562세포주；이용RT-PCR화류식세포술검측HLA-A* 1101기인화단백적표술정황.결과표명,성공구건료이2A태기인위련접자적HLA-A* 1101-T2A-EGFP진핵표체재체；중조질립전염적K562세포경G418사선2개월후,획득2주표체록색형광단백적K562은정세포주HLA-A* 1101 +K562화pEGFP-N3+ K562.RT-PCR검측증명,HLA-A* 1101+ K562세포표체HLA-A* 1101기인,이pEGFP-N3+ K562세포칙불표체HLA-A*1101；류식세포술분석현시,HLA-A* 1101화GFP단백쌍양성HLA-A*1101+K562세포점88.5％,명현고우pEGFP-N3+ K562세포(0.698％).결론:건립료일개간단유효지사선HLA-A+ 1101+ K562세포주적방법,병성공지건립료막은정표체HLA-A*1101단백적K562세포주,위진일보연구CML적특이성세포면역제공공구세포.