目的:探讨谷胱甘肽巯基转移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因沉默对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145增殖活性和对化学治疗药物敏感性的影响.方法:根据选取靶序列形成短发卡状RNA(short hairpinRNA,shRNA)的DNA模板设计3条表达载体(shRNA255,shRNA554,shRNA593),并克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo.经酶切和测序鉴定,筛选转染率最高基因沉默效果最好的shRNA作RNA干扰.DU145细胞株分为空白质粒转染组和shRNA转染组.转染前后按化学治疗药物分为氟尿嘧啶(fluorouracil,FU)组及紫杉醇(paclitaxel,PA)组,并按作用浓度(FU:30,60,120,240 μg/mL; PA:0.2,2,10,20μg/mL)分别分成4个亚组,并分别设有一个空白对照组.四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法检测转染后细胞增殖活性的变化,MTT及末端脱氧核苷酸转移酶介导脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记法(terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)检测转染前后不同浓度FU和PA对DU145细胞抑制增殖及诱导凋亡的效果.结果:3条表达载体(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255,pGPU6/GFP/Neo-shRNA554,pGPU6/GFP/Neo-shRNA593)的转染率分别为(63.3±1.04)％,(76.2±0.68)％,(72.7±0.33)％,shRNA554转染率最高,三者之间比较差异有统计学意义(P＜0.01).转染后mRNA含量分别为128.31±2.50,43.24±4.30和85.62±6.30,GSTP1蛋白含量分另为163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shRNA554转染后GSTP1基因mRNA和蛋白含量均最低,三者比较差异有统计学意义(P＜0.01).MTT检测转染前FU不同浓度(30,60,120,240 μg/mL)四个亚组作用后细胞存活率分别为(95.60±2.11)％,(90.20±0.86)％,(83.10±3.12)％和(74.60±1.32)％；转染后存活率为(91.30±1.43)％,(84.6±2.13)％,(73.2±1.52)％和(65.5±0.94)％.TUNEL检测转染前FU不同浓度(30,60,120,240.μg/mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(5.50±0.88)％,(10.20±1.64)％,(15.20±2.39)％和(25.10±2.59)％；转染后凋亡率(10.80±0.62)％,(15.70±1.32)％,(20.40±1.89)％和(34.90±2.54)％.转染后相同FU浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(p＜0.01).MTT检测转染前PA不同浓度(0.2,2,10,20 μg/mL)四个亚组作用后细胞存活率为(98.50±2.34)％,(95.20±1.32)％,(89.40±0.68)％和(82.70±1.73)％；转染后存活率为(94.2±0.78)％,(86.5±2.13)％,(78.7±1.34)％和(70.1±0.76)％.TUNEL检测转染前PA不同浓度(0.2,2,10,20 μg/mL)四个亚组作用后细胞凋亡率分别为(2.4±1.07)％,(5.2±1.33)％,(10.5±2.41)％和(20.7±1.92)％；转染后凋亡率(5.46±2.13)％,(13.8±1.24)％,(21.2±2.39)％和(29.2±2.21)％.转染后相同PA浓度下细胞存活率降低,凋亡率增加,差异均具有统计学意义(P＜0.01).结论:shRNA介导的GSTP1基因沉默可抑制雄激素非依赖型前列腺癌DU145细胞增殖活性,诱导凋亡,并且其作用呈现时间依赖性,可提高其对于化学治疗的药物敏感性.
目的:探討穀胱甘肽巰基轉移酶P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1)基因沉默對雄激素非依賴性前列腺癌細胞株DU145增殖活性和對化學治療藥物敏感性的影響.方法:根據選取靶序列形成短髮卡狀RNA(short hairpinRNA,shRNA)的DNA模闆設計3條錶達載體(shRNA255,shRNA554,shRNA593),併剋隆到質粒pGPU6/GFP/Neo.經酶切和測序鑒定,篩選轉染率最高基因沉默效果最好的shRNA作RNA榦擾.DU145細胞株分為空白質粒轉染組和shRNA轉染組.轉染前後按化學治療藥物分為氟尿嘧啶(fluorouracil,FU)組及紫杉醇(paclitaxel,PA)組,併按作用濃度(FU:30,60,120,240 μg/mL; PA:0.2,2,10,20μg/mL)分彆分成4箇亞組,併分彆設有一箇空白對照組.四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]比色法檢測轉染後細胞增殖活性的變化,MTT及末耑脫氧覈苷痠轉移酶介導脫氧尿苷三燐痠缺口末耑標記法(terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測轉染前後不同濃度FU和PA對DU145細胞抑製增殖及誘導凋亡的效果.結果:3條錶達載體(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255,pGPU6/GFP/Neo-shRNA554,pGPU6/GFP/Neo-shRNA593)的轉染率分彆為(63.3±1.04)％,(76.2±0.68)％,(72.7±0.33)％,shRNA554轉染率最高,三者之間比較差異有統計學意義(P＜0.01).轉染後mRNA含量分彆為128.31±2.50,43.24±4.30和85.62±6.30,GSTP1蛋白含量分另為163.92±12.40,65.38±9.30和114.25±16.70,shRNA554轉染後GSTP1基因mRNA和蛋白含量均最低,三者比較差異有統計學意義(P＜0.01).MTT檢測轉染前FU不同濃度(30,60,120,240 μg/mL)四箇亞組作用後細胞存活率分彆為(95.60±2.11)％,(90.20±0.86)％,(83.10±3.12)％和(74.60±1.32)％；轉染後存活率為(91.30±1.43)％,(84.6±2.13)％,(73.2±1.52)％和(65.5±0.94)％.TUNEL檢測轉染前FU不同濃度(30,60,120,240.μg/mL)四箇亞組作用後細胞凋亡率分彆為(5.50±0.88)％,(10.20±1.64)％,(15.20±2.39)％和(25.10±2.59)％；轉染後凋亡率(10.80±0.62)％,(15.70±1.32)％,(20.40±1.89)％和(34.90±2.54)％.轉染後相同FU濃度下細胞存活率降低,凋亡率增加,差異均具有統計學意義(p＜0.01).MTT檢測轉染前PA不同濃度(0.2,2,10,20 μg/mL)四箇亞組作用後細胞存活率為(98.50±2.34)％,(95.20±1.32)％,(89.40±0.68)％和(82.70±1.73)％；轉染後存活率為(94.2±0.78)％,(86.5±2.13)％,(78.7±1.34)％和(70.1±0.76)％.TUNEL檢測轉染前PA不同濃度(0.2,2,10,20 μg/mL)四箇亞組作用後細胞凋亡率分彆為(2.4±1.07)％,(5.2±1.33)％,(10.5±2.41)％和(20.7±1.92)％；轉染後凋亡率(5.46±2.13)％,(13.8±1.24)％,(21.2±2.39)％和(29.2±2.21)％.轉染後相同PA濃度下細胞存活率降低,凋亡率增加,差異均具有統計學意義(P＜0.01).結論:shRNA介導的GSTP1基因沉默可抑製雄激素非依賴型前列腺癌DU145細胞增殖活性,誘導凋亡,併且其作用呈現時間依賴性,可提高其對于化學治療的藥物敏感性.
목적:탐토곡광감태구기전이매P1 (glutathione S-transferase P1,GSTP1)기인침묵대웅격소비의뢰성전렬선암세포주DU145증식활성화대화학치료약물민감성적영향.방법:근거선취파서렬형성단발잡상RNA(short hairpinRNA,shRNA)적DNA모판설계3조표체재체(shRNA255,shRNA554,shRNA593),병극륭도질립pGPU6/GFP/Neo.경매절화측서감정,사선전염솔최고기인침묵효과최호적shRNA작RNA간우.DU145세포주분위공백질립전염조화shRNA전염조.전염전후안화학치료약물분위불뇨밀정(fluorouracil,FU)조급자삼순(paclitaxel,PA)조,병안작용농도(FU:30,60,120,240 μg/mL; PA:0.2,2,10,20μg/mL)분별분성4개아조,병분별설유일개공백대조조.사갑기우담서염[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,MTT]비색법검측전염후세포증식활성적변화,MTT급말단탈양핵감산전이매개도탈양뇨감삼린산결구말단표기법(terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)검측전염전후불동농도FU화PA대DU145세포억제증식급유도조망적효과.결과:3조표체재체(pGPU6/GFP/Neo-shRNA255,pGPU6/GFP/Neo-shRNA554,pGPU6/GFP/Neo-shRNA593)적전염솔분별위(63.3±1.04)％,(76.2±0.68)％,(72.7±0.33)％,shRNA554전염솔최고,삼자지간비교차이유통계학의의(P＜0.01).전염후mRNA함량분별위128.31±2.50,43.24±4.30화85.62±6.30,GSTP1단백함량분령위163.92±12.40,65.38±9.30화114.25±16.70,shRNA554전염후GSTP1기인mRNA화단백함량균최저,삼자비교차이유통계학의의(P＜0.01).MTT검측전염전FU불동농도(30,60,120,240 μg/mL)사개아조작용후세포존활솔분별위(95.60±2.11)％,(90.20±0.86)％,(83.10±3.12)％화(74.60±1.32)％；전염후존활솔위(91.30±1.43)％,(84.6±2.13)％,(73.2±1.52)％화(65.5±0.94)％.TUNEL검측전염전FU불동농도(30,60,120,240.μg/mL)사개아조작용후세포조망솔분별위(5.50±0.88)％,(10.20±1.64)％,(15.20±2.39)％화(25.10±2.59)％；전염후조망솔(10.80±0.62)％,(15.70±1.32)％,(20.40±1.89)％화(34.90±2.54)％.전염후상동FU농도하세포존활솔강저,조망솔증가,차이균구유통계학의의(p＜0.01).MTT검측전염전PA불동농도(0.2,2,10,20 μg/mL)사개아조작용후세포존활솔위(98.50±2.34)％,(95.20±1.32)％,(89.40±0.68)％화(82.70±1.73)％；전염후존활솔위(94.2±0.78)％,(86.5±2.13)％,(78.7±1.34)％화(70.1±0.76)％.TUNEL검측전염전PA불동농도(0.2,2,10,20 μg/mL)사개아조작용후세포조망솔분별위(2.4±1.07)％,(5.2±1.33)％,(10.5±2.41)％화(20.7±1.92)％；전염후조망솔(5.46±2.13)％,(13.8±1.24)％,(21.2±2.39)％화(29.2±2.21)％.전염후상동PA농도하세포존활솔강저,조망솔증가,차이균구유통계학의의(P＜0.01).결론:shRNA개도적GSTP1기인침묵가억제웅격소비의뢰형전렬선암DU145세포증식활성,유도조망,병차기작용정현시간의뢰성,가제고기대우화학치료적약물민감성.
