徐州医学院学报
徐州醫學院學報
서주의학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU
2012年
9期
601-607
,共7页
李海龙%温儒民%薛松%肖永双%孙晓青
李海龍%溫儒民%薛鬆%肖永雙%孫曉青
리해룡%온유민%설송%초영쌍%손효청
Fas蛋白(CD95)%RNA干扰%shRNA%移植免疫耐受
Fas蛋白(CD95)%RNA榦擾%shRNA%移植免疫耐受
Fas단백(CD95)%RNA간우%shRNA%이식면역내수
目的 构建大鼠Fas shRNA真核表达重组质粒,并检测其对NRK-52E细胞(大鼠肾小管上皮细胞)Fas基因的沉默效率,筛选出一个最有效干扰质粒.方法 按照siRNA设计原则,在大鼠Fas基因mRNA上挑选4个干扰靶序列,再根据靶序列分别设计并合成两端含有酶切位点的总长度为64 bp的shRNA转录模板DNA正、反义寡核苷酸链,并将其退火后克隆至空载体pSliencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector中,对其进行鉴定.用Lipofectamine LTX Reagent将pSilencer Fas(1～4)4个重组质粒转染至大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)内,以pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N1质粒共转染做阳性对照,经过G418压力性筛选后,使用RT-PCR和蛋白免疫印迹法分析针对Fas基因构建的4个重组质粒的有效性,筛选出最有效的干扰质粒.结果 pSilencer-Fas (1~4) shRNA及pSilencer-EGFP shRNA重组质粒测序结果与预期序列相同.RT-PCR及蛋白免疫印迹结果显示pSilencer-Fas4 shRNA对Fas基因在mRNA水平和蛋白水平的抑制率均最高,分别达到(78.9±3.2)%和(64.5±4.62)%.结论 利用RNA干扰技术沉默大鼠Fas基因,可以降低大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)Fas的表达.
目的 構建大鼠Fas shRNA真覈錶達重組質粒,併檢測其對NRK-52E細胞(大鼠腎小管上皮細胞)Fas基因的沉默效率,篩選齣一箇最有效榦擾質粒.方法 按照siRNA設計原則,在大鼠Fas基因mRNA上挑選4箇榦擾靶序列,再根據靶序列分彆設計併閤成兩耑含有酶切位點的總長度為64 bp的shRNA轉錄模闆DNA正、反義寡覈苷痠鏈,併將其退火後剋隆至空載體pSliencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector中,對其進行鑒定.用Lipofectamine LTX Reagent將pSilencer Fas(1～4)4箇重組質粒轉染至大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)內,以pSilencer-EGFP shRNA和pEGFP-N1質粒共轉染做暘性對照,經過G418壓力性篩選後,使用RT-PCR和蛋白免疫印跡法分析針對Fas基因構建的4箇重組質粒的有效性,篩選齣最有效的榦擾質粒.結果 pSilencer-Fas (1~4) shRNA及pSilencer-EGFP shRNA重組質粒測序結果與預期序列相同.RT-PCR及蛋白免疫印跡結果顯示pSilencer-Fas4 shRNA對Fas基因在mRNA水平和蛋白水平的抑製率均最高,分彆達到(78.9±3.2)%和(64.5±4.62)%.結論 利用RNA榦擾技術沉默大鼠Fas基因,可以降低大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)Fas的錶達.
목적 구건대서Fas shRNA진핵표체중조질립,병검측기대NRK-52E세포(대서신소관상피세포)Fas기인적침묵효솔,사선출일개최유효간우질립.방법 안조siRNA설계원칙,재대서Fas기인mRNA상도선4개간우파서렬,재근거파서렬분별설계병합성량단함유매절위점적총장도위64 bp적shRNA전록모판DNA정、반의과핵감산련,병장기퇴화후극륭지공재체pSliencerTM3.1-H1 neo siRNA Expression Vector중,대기진행감정.용Lipofectamine LTX Reagent장pSilencer Fas(1～4)4개중조질립전염지대서신소관상피세포(NRK-52E)내,이pSilencer-EGFP shRNA화pEGFP-N1질립공전염주양성대조,경과G418압력성사선후,사용RT-PCR화단백면역인적법분석침대Fas기인구건적4개중조질립적유효성,사선출최유효적간우질립.결과 pSilencer-Fas (1~4) shRNA급pSilencer-EGFP shRNA중조질립측서결과여예기서렬상동.RT-PCR급단백면역인적결과현시pSilencer-Fas4 shRNA대Fas기인재mRNA수평화단백수평적억제솔균최고,분별체도(78.9±3.2)%화(64.5±4.62)%.결론 이용RNA간우기술침묵대서Fas기인,가이강저대서신소관상피세포(NRK-52E)Fas적표체.
