安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2011年
2期
116-119
,共4页
杨军%陈应炉%汪云飞%朱恒锐%刘晓颖%范礼斌
楊軍%陳應爐%汪雲飛%硃恆銳%劉曉穎%範禮斌
양군%진응로%왕운비%주항예%류효영%범례빈
基因表达%转染%印迹法,蛋白质%核蛋白类
基因錶達%轉染%印跡法,蛋白質%覈蛋白類
기인표체%전염%인적법,단백질%핵단백류
目的 构建带HA标签(标签序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇)的PAM14缺失突变体PAM14-N和PAM14-C的真核表达载体,将其分别转染至COS7细胞中观察PAM14-N和PAM14-C蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其是否表达.方法 以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pACT2-PAM14为模板,PCR法扩增PAM14-N-HA,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后插入真核表达载体pCDNA3.1中,同理构建pCDNA3.1-HA-PAM14-C,将重组表达质粒pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDNA3.1-HA-PAM14-C分别转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体 pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDNA3.1-HA-PAM14-C,转染后荧光显微镜观察PAM14-N在COS7细胞中主要定位于细胞核,PAM14-C定位不明显;经Western blot检测PAM14-N在HEK293T细胞中能够有效表达,PAM14-C无表达.结论 实验结果确定了PAM14功能最小区域及PAM14-N的定位和表达,为进一步了解PAM14的功能奠定了基础.
目的 構建帶HA標籤(標籤序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的紅細胞凝集素錶麵抗原決定簇)的PAM14缺失突變體PAM14-N和PAM14-C的真覈錶達載體,將其分彆轉染至COS7細胞中觀察PAM14-N和PAM14-C蛋白在細胞內的定位,併轉染至HEK293T細胞檢測其是否錶達.方法 以含人PAM14全長cDNA序列的質粒pACT2-PAM14為模闆,PCR法擴增PAM14-N-HA,BamHⅠ和HindⅢ雙酶切後插入真覈錶達載體pCDNA3.1中,同理構建pCDNA3.1-HA-PAM14-C,將重組錶達質粒pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDNA3.1-HA-PAM14-C分彆轉染至COS7細胞,在熒光顯微鏡下觀察其細胞定位.轉染至HEK293T細胞,提取總蛋白,進行Western blot檢測.結果 經測序鑒定,成功構建瞭真覈錶達載體 pCDNA3.1-PAM14-N-HA和pCDNA3.1-HA-PAM14-C,轉染後熒光顯微鏡觀察PAM14-N在COS7細胞中主要定位于細胞覈,PAM14-C定位不明顯;經Western blot檢測PAM14-N在HEK293T細胞中能夠有效錶達,PAM14-C無錶達.結論 實驗結果確定瞭PAM14功能最小區域及PAM14-N的定位和錶達,為進一步瞭解PAM14的功能奠定瞭基礎.
목적 구건대HA표첨(표첨서렬YPYDVPDYA,원우류감병독적홍세포응집소표면항원결정족)적PAM14결실돌변체PAM14-N화PAM14-C적진핵표체재체,장기분별전염지COS7세포중관찰PAM14-N화PAM14-C단백재세포내적정위,병전염지HEK293T세포검측기시부표체.방법 이함인PAM14전장cDNA서렬적질립pACT2-PAM14위모판,PCR법확증PAM14-N-HA,BamHⅠ화HindⅢ쌍매절후삽입진핵표체재체pCDNA3.1중,동리구건pCDNA3.1-HA-PAM14-C,장중조표체질립pCDNA3.1-PAM14-N-HA화pCDNA3.1-HA-PAM14-C분별전염지COS7세포,재형광현미경하관찰기세포정위.전염지HEK293T세포,제취총단백,진행Western blot검측.결과 경측서감정,성공구건료진핵표체재체 pCDNA3.1-PAM14-N-HA화pCDNA3.1-HA-PAM14-C,전염후형광현미경관찰PAM14-N재COS7세포중주요정위우세포핵,PAM14-C정위불명현;경Western blot검측PAM14-N재HEK293T세포중능구유효표체,PAM14-C무표체.결론 실험결과학정료PAM14공능최소구역급PAM14-N적정위화표체,위진일보료해PAM14적공능전정료기출.
