CAJ | 학술논문

目的:研究具有生物学活性的人防御素2(HBD2)多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术.方法:PCR扩增不合前导序列的HBD2成熟肽的编码框全长的cDNA片段(smHBD2-cDNA),利用BglⅡ和BamH Ⅰ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD2-cDNA的克隆载体,利用Ncol Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶构建融合表达载体pET32-nsmHBD2-cDNA,在大肠杆菌中BL21(DE3)中诱导表达含HBD2的融合蛋白,SDS-PAGE分析产量.可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD2多肽.采用液体培养法,测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性.结果:构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD2-cDNA表达载体,1、2和4倍smHBD2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52%、48%和31%;而8倍HBD2-cDNA几乎不合可溶蛋白,目标蛋白以包含体形式表达,集中在不可溶部分.重组HBD2对E.coli K12 D31有较强的抑制作用,在终浓度约为0.4至0.5μg/ml时,90%细胞的生长被抑制.结论:采用融合表达、多拷贝串联表达方式,可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用,也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性;适当的多拷贝串联基因可以提高HBD2的产量,但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量,且易形成不溶蛋白;在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD2多肽的原核高效表达.
목적:연구구유생물학활성적인방어소2(HBD2)다태재대장간균중적원핵고효표체적가행성급융합표체단백적분리순화기술.방법:PCR확증불합전도서렬적HBD2성숙태적편마광전장적cDNA편단(smHBD2-cDNA),이용BglⅡ화BamH Ⅰ동미매구건다고패천련적nsmHBD2-cDNA적극륭재체,이용Ncol Ⅰ화Hind Ⅲ한제성내절매구건융합표체재체pET32-nsmHBD2-cDNA,재대장간균중BL21(DE3)중유도표체함HBD2적융합단백,SDS-PAGE분석산량.가용단백경친화층석、장격매매절、리자교환층석등방법분리、순화HBD2다태.채용액체배양법,측정중조인β방어소2대대장간균적억균활성.결과:구건료n위1、2、4혹8배적다고패천련nsmHBD2-cDNA표체재체,1、2화4배smHBD2-cDNA적가용단백비례분별위52%、48%화31%;이8배HBD2-cDNA궤호불합가용단백,목표단백이포함체형식표체,집중재불가용부분.중조HBD2대E.coli K12 D31유교강적억제작용,재종농도약위0.4지0.5μg/ml시,90%세포적생장피억제.결론:채용융합표체、다고패천련표체방식,가증가산물장도이약화단백매적강해작용,야감약료목표단백산물대숙주적독성;괄당적다고패천련기인가이제고HBD2적산량,단고패수과고회영향중조단백표체산량,차역형성불용단백;재대장간균중가체도구유생물학활성적HBD2다태적원핵고효표체.