生物技术通报
生物技術通報
생물기술통보
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2008年
z1期
149-154
,共6页
吴芳明%韩春光%彭明丽%黄琳仪%王琼%朱欣凯%刘永学
吳芳明%韓春光%彭明麗%黃琳儀%王瓊%硃訢凱%劉永學
오방명%한춘광%팽명려%황림의%왕경%주흔개%류영학
GPR81%Gi1α融合蛋白%bac-to-bac杆状病毒表达
GPR81%Gi1α融閤蛋白%bac-to-bac桿狀病毒錶達
GPR81%Gi1α융합단백%bac-to-bac간상병독표체
旨在建立获得融合蛋白GPR81-Gi1α的方法和最优条件.采用RT-PCR从人胚胎肾及大脑组织总RNA中分别扩增孤儿G蛋白偶联受体GPR81和Gi1α的完整表达序列(分别为1 041bp和1 065bp),并构建各自的重组质粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gila,再以重组质粒为模板,运用重叠延伸PCR法扩增得到融合基因GPR81-Gi1a,测序无误后将融合基因与pFASTBacl重组得重组质粒pFASTBacl-GPR81-Gi1α.而后转化DH10Bac,使该融合基因重组质粒发生特异性的转座和病毒重组,获得杆状病毒表达穿梭质粒pBacmid-GPR81-Gi1α,再将该重组杆粒转染昆虫sf9细胞,获得含杆状病毒的细胞分泌上清,以上清在不同条件下(包括不同感染时间、滴度等)感染sf9细胞以优化融合蛋白在昆虫sf9细胞的表达条件.结果表明,感染72h且感染强度moi为5时是融合蛋白在sf9细胞中高效表达的理想条件.该表达体系的建立及蛋白表达条件的优化,保证了足量GPR81-Gi1α融合蛋白的制备.
旨在建立穫得融閤蛋白GPR81-Gi1α的方法和最優條件.採用RT-PCR從人胚胎腎及大腦組織總RNA中分彆擴增孤兒G蛋白偶聯受體GPR81和Gi1α的完整錶達序列(分彆為1 041bp和1 065bp),併構建各自的重組質粒pcDNA3.1(+)-GPR81及pcDNA3.1(+)-Gila,再以重組質粒為模闆,運用重疊延伸PCR法擴增得到融閤基因GPR81-Gi1a,測序無誤後將融閤基因與pFASTBacl重組得重組質粒pFASTBacl-GPR81-Gi1α.而後轉化DH10Bac,使該融閤基因重組質粒髮生特異性的轉座和病毒重組,穫得桿狀病毒錶達穿梭質粒pBacmid-GPR81-Gi1α,再將該重組桿粒轉染昆蟲sf9細胞,穫得含桿狀病毒的細胞分泌上清,以上清在不同條件下(包括不同感染時間、滴度等)感染sf9細胞以優化融閤蛋白在昆蟲sf9細胞的錶達條件.結果錶明,感染72h且感染彊度moi為5時是融閤蛋白在sf9細胞中高效錶達的理想條件.該錶達體繫的建立及蛋白錶達條件的優化,保證瞭足量GPR81-Gi1α融閤蛋白的製備.
지재건립획득융합단백GPR81-Gi1α적방법화최우조건.채용RT-PCR종인배태신급대뇌조직총RNA중분별확증고인G단백우련수체GPR81화Gi1α적완정표체서렬(분별위1 041bp화1 065bp),병구건각자적중조질립pcDNA3.1(+)-GPR81급pcDNA3.1(+)-Gila,재이중조질립위모판,운용중첩연신PCR법확증득도융합기인GPR81-Gi1a,측서무오후장융합기인여pFASTBacl중조득중조질립pFASTBacl-GPR81-Gi1α.이후전화DH10Bac,사해융합기인중조질립발생특이성적전좌화병독중조,획득간상병독표체천사질립pBacmid-GPR81-Gi1α,재장해중조간립전염곤충sf9세포,획득함간상병독적세포분비상청,이상청재불동조건하(포괄불동감염시간、적도등)감염sf9세포이우화융합단백재곤충sf9세포적표체조건.결과표명,감염72h차감염강도moi위5시시융합단백재sf9세포중고효표체적이상조건.해표체체계적건립급단백표체조건적우화,보증료족량GPR81-Gi1α융합단백적제비.
