CAJ | 학술논문

目的:构建表达人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)基因的腺病毒重组体,体外感染骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)细胞系U2OS,并鉴定LMP-1基因在U2OS中的表达.方法:以K562细胞的cDNA为文库,采用PCR方法对LMP-1进行扩增,通过TA克隆与pGEM-T载体连接并DNA测序.双酶切后并将目的基因插入至腺病毒穿梭质粒pAdtrackCMV,对腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1行双酶切和DNA测序鉴定,并通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测pAdtrack-CMV-LMP-1在HEK-293T细胞中的表达.线性化pAdtrack-CMV-LMP-1,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdeasy-1的同源重组,构建重组腺病毒质粒Ad-LMP-1.通过脂质体介导,在HEK-293A细胞内包装出复制缺陷的重组腺病毒Ad-LMP-1,大量扩增、纯化并测定滴度.用Ad-LMP-1感染OS细胞系U2OS,通过荧光显微镜、RT-qPCR和Western blot检测LMP-1在U2OS细胞中的表达.结果:双酶切和DNA测序鉴定穿梭质粒pAdtrack-CMV-LMP-1构建成功,荧光显微镜证实转染了pAdtrack-CMV-LMP-1质粒的HEK-293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot验证了LMP-1基因的表达量明显高于对照组.通过扩增、纯化,Ad-LMP-1滴度达到1.5×109 pfu/ml.荧光显微镜下观察重组腺病毒感染的U2OS内有绿色荧光蛋白表达,RT-qPCR和Western blot检测发现重组腺病毒感染U2OS后,LMP-1的mRNA和蛋白表达量明显高于对照组.结论:成功构建了人LMP-1基因腺病毒重组体,为进一步的实验研究奠定了基础.
목적:구건표체인LIM광화단백-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)기인적선병독중조체,체외감염골육류(Osteosarcoma,OS)세포계U2OS,병감정LMP-1기인재U2OS중적표체.방법:이K562세포적cDNA위문고,채용PCR방법대LMP-1진행확증,통과TA극륭여pGEM-T재체련접병DNA측서.쌍매절후병장목적기인삽입지선병독천사질립pAdtrackCMV,대선병독천사질립pAdtrack-CMV-LMP-1행쌍매절화DNA측서감정,병통과형광현미경、RT-qPCR화Western blot검측pAdtrack-CMV-LMP-1재HEK-293T세포중적표체.선성화pAdtrack-CMV-LMP-1,재BJ5183균내완성여골가질립pAdeasy-1적동원중조,구건중조선병독질립Ad-LMP-1.통과지질체개도,재HEK-293A세포내포장출복제결함적중조선병독Ad-LMP-1,대량확증、순화병측정적도.용Ad-LMP-1감염OS세포계U2OS,통과형광현미경、RT-qPCR화Western blot검측LMP-1재U2OS세포중적표체.결과:쌍매절화DNA측서감정천사질립pAdtrack-CMV-LMP-1구건성공,형광현미경증실전염료pAdtrack-CMV-LMP-1질립적HEK-293T세포내유록색형광단백표체,RT-qPCR화Western blot험증료LMP-1기인적표체량명현고우대조조.통과확증、순화,Ad-LMP-1적도체도1.5×109 pfu/ml.형광현미경하관찰중조선병독감염적U2OS내유록색형광단백표체,RT-qPCR화Western blot검측발현중조선병독감염U2OS후,LMP-1적mRNA화단백표체량명현고우대조조.결론:성공구건료인LMP-1기인선병독중조체,위진일보적실험연구전정료기출.