中国药理学与毒理学杂志
中國藥理學與毒理學雜誌
중국약이학여독이학잡지
CHINESE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND TOXICOLOGY
2011年
5期
447-455
,共9页
赵宇%武军华%贾培嫒%吴少平%高珊%王晨宇%黄春倩%王玉霞
趙宇%武軍華%賈培嬡%吳少平%高珊%王晨宇%黃春倩%王玉霞
조우%무군화%가배애%오소평%고산%왕신우%황춘천%왕옥하
低氧%依赖性降解结构%TAT%增强型绿色荧光蛋白
低氧%依賴性降解結構%TAT%增彊型綠色熒光蛋白
저양%의뢰성강해결구%TAT%증강형록색형광단백
目的 研究反式激活蛋白(TAT)蛋白转导结构域介导的融合蛋白的跨膜转运,以及氧依赖性降解(ODD)结构域介导融合蛋白在体内外不同氧分压环境中的降解作用.方法 将TAT,ODD以及增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列进行融合,构建了TAT-ODD-EGFP融合蛋白基因.将该序列克隆到原核表达载体pET28a中,在BL21工程菌中进行表达,通过亲和柱层析法纯化,得到高纯度的融合蛋白.同方法制备EGFP和TAT-EGFP融合蛋白作为对照.在20% O2和1%O2将融合蛋白与A549,H1299和MDA-MB-231细胞系孵育,荧光显微镜下观察融合蛋白在细胞中的分布以及稳定性.小鼠尾静脉注射不同融合蛋白( 10 mg·kg-1),分别在注射后1,6和12 h处死动物,取脏器在荧光显微镜下观察融合蛋白的分布及稳定性.结果 由于EGFP相对分子质量大,无法穿透细胞及组织.TAT可以有效地介导TAT-EGFP进入细胞和动物实体组织,其稳定性不受细胞或组织中氧分压的影响,而TAT-ODD-EGFP进入细胞或组织后,在20% O2条件下迅速降解,但可稳定存在于1% O2细胞及组织中.结论 TAT可以有效地转导融合蛋白穿过细胞膜.引入ODD,20%O2下融合蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以稳定存在于1% O2细胞和组织中,说明TAT-ODD可以转导蛋白进入并靶向存在于低氧的肿瘤组织中.
目的 研究反式激活蛋白(TAT)蛋白轉導結構域介導的融閤蛋白的跨膜轉運,以及氧依賴性降解(ODD)結構域介導融閤蛋白在體內外不同氧分壓環境中的降解作用.方法 將TAT,ODD以及增彊綠色熒光蛋白(EGFP)基因序列進行融閤,構建瞭TAT-ODD-EGFP融閤蛋白基因.將該序列剋隆到原覈錶達載體pET28a中,在BL21工程菌中進行錶達,通過親和柱層析法純化,得到高純度的融閤蛋白.同方法製備EGFP和TAT-EGFP融閤蛋白作為對照.在20% O2和1%O2將融閤蛋白與A549,H1299和MDA-MB-231細胞繫孵育,熒光顯微鏡下觀察融閤蛋白在細胞中的分佈以及穩定性.小鼠尾靜脈註射不同融閤蛋白( 10 mg·kg-1),分彆在註射後1,6和12 h處死動物,取髒器在熒光顯微鏡下觀察融閤蛋白的分佈及穩定性.結果 由于EGFP相對分子質量大,無法穿透細胞及組織.TAT可以有效地介導TAT-EGFP進入細胞和動物實體組織,其穩定性不受細胞或組織中氧分壓的影響,而TAT-ODD-EGFP進入細胞或組織後,在20% O2條件下迅速降解,但可穩定存在于1% O2細胞及組織中.結論 TAT可以有效地轉導融閤蛋白穿過細胞膜.引入ODD,20%O2下融閤蛋白TAT-ODD-EGFP迅速降解,但可以穩定存在于1% O2細胞和組織中,說明TAT-ODD可以轉導蛋白進入併靶嚮存在于低氧的腫瘤組織中.
목적 연구반식격활단백(TAT)단백전도결구역개도적융합단백적과막전운,이급양의뢰성강해(ODD)결구역개도융합단백재체내외불동양분압배경중적강해작용.방법 장TAT,ODD이급증강록색형광단백(EGFP)기인서렬진행융합,구건료TAT-ODD-EGFP융합단백기인.장해서렬극륭도원핵표체재체pET28a중,재BL21공정균중진행표체,통과친화주층석법순화,득도고순도적융합단백.동방법제비EGFP화TAT-EGFP융합단백작위대조.재20% O2화1%O2장융합단백여A549,H1299화MDA-MB-231세포계부육,형광현미경하관찰융합단백재세포중적분포이급은정성.소서미정맥주사불동융합단백( 10 mg·kg-1),분별재주사후1,6화12 h처사동물,취장기재형광현미경하관찰융합단백적분포급은정성.결과 유우EGFP상대분자질량대,무법천투세포급조직.TAT가이유효지개도TAT-EGFP진입세포화동물실체조직,기은정성불수세포혹조직중양분압적영향,이TAT-ODD-EGFP진입세포혹조직후,재20% O2조건하신속강해,단가은정존재우1% O2세포급조직중.결론 TAT가이유효지전도융합단백천과세포막.인입ODD,20%O2하융합단백TAT-ODD-EGFP신속강해,단가이은정존재우1% O2세포화조직중,설명TAT-ODD가이전도단백진입병파향존재우저양적종류조직중.
