中国病毒学
中國病毒學
중국병독학
VIROLOGICA SINICA
2002年
1期
60-65
,共6页
冯磊%叶林柏%阮华%郜金荣%徐进平%刘源洁%吴正辉
馮磊%葉林柏%阮華%郜金榮%徐進平%劉源潔%吳正輝
풍뢰%협림백%원화%고금영%서진평%류원길%오정휘
NCV%NS5A%表达%免疫荧光%免疫组化
NCV%NS5A%錶達%免疫熒光%免疫組化
NCV%NS5A%표체%면역형광%면역조화
应用PCR方法从含有丙肝病毒全部非结构蛋白基因的质粒pBAC25中扩增出全长的NS5A基因DNA片段(约1.34kb),PCR扩增NS5A基因片段克隆到转移载体pBlueBacHisA中.重组转移质粒pBlueBacHis5A DNA与野生型杆状病毒(AcNPV)DNA共转染SF-9昆虫细胞,通过空斑纯化获得带有NS5A基因的重组病AcNS5A.对重组病毒基因组DNA进行酶切和PCR鉴定,证实HCV NS5A基因已插入重组病毒基因组中.AcNS5A感染SF-9细胞后,在细胞中表达出一条64kD的蛋白,用Western-blot分析,结果表明这种蛋白与抗HCV HS5A特异性抗体发生强烈反应,说明NS5A基因已在细胞中得到表达,应用免疫荧光技术与免疫组化技术进一步研究NS5A蛋白在昆虫细胞中不同时间的表达情况及其分布,结果表明,NS5A蛋白在AcNS5A重组病毒感染细胞24h后主要分布在细胞质膜上,而在48h后则同时分布于细胞质膜和细胞核内,在72h则完全布满整个细胞,我们认为NS5A蛋白定位于质膜和细胞核中,暗示着在病毒复制过程中NS5A蛋白可能参与病毒RNA在质膜上复制和细胞基因表达的调控.
應用PCR方法從含有丙肝病毒全部非結構蛋白基因的質粒pBAC25中擴增齣全長的NS5A基因DNA片段(約1.34kb),PCR擴增NS5A基因片段剋隆到轉移載體pBlueBacHisA中.重組轉移質粒pBlueBacHis5A DNA與野生型桿狀病毒(AcNPV)DNA共轉染SF-9昆蟲細胞,通過空斑純化穫得帶有NS5A基因的重組病AcNS5A.對重組病毒基因組DNA進行酶切和PCR鑒定,證實HCV NS5A基因已插入重組病毒基因組中.AcNS5A感染SF-9細胞後,在細胞中錶達齣一條64kD的蛋白,用Western-blot分析,結果錶明這種蛋白與抗HCV HS5A特異性抗體髮生彊烈反應,說明NS5A基因已在細胞中得到錶達,應用免疫熒光技術與免疫組化技術進一步研究NS5A蛋白在昆蟲細胞中不同時間的錶達情況及其分佈,結果錶明,NS5A蛋白在AcNS5A重組病毒感染細胞24h後主要分佈在細胞質膜上,而在48h後則同時分佈于細胞質膜和細胞覈內,在72h則完全佈滿整箇細胞,我們認為NS5A蛋白定位于質膜和細胞覈中,暗示著在病毒複製過程中NS5A蛋白可能參與病毒RNA在質膜上複製和細胞基因錶達的調控.
응용PCR방법종함유병간병독전부비결구단백기인적질립pBAC25중확증출전장적NS5A기인DNA편단(약1.34kb),PCR확증NS5A기인편단극륭도전이재체pBlueBacHisA중.중조전이질립pBlueBacHis5A DNA여야생형간상병독(AcNPV)DNA공전염SF-9곤충세포,통과공반순화획득대유NS5A기인적중조병AcNS5A.대중조병독기인조DNA진행매절화PCR감정,증실HCV NS5A기인이삽입중조병독기인조중.AcNS5A감염SF-9세포후,재세포중표체출일조64kD적단백,용Western-blot분석,결과표명저충단백여항HCV HS5A특이성항체발생강렬반응,설명NS5A기인이재세포중득도표체,응용면역형광기술여면역조화기술진일보연구NS5A단백재곤충세포중불동시간적표체정황급기분포,결과표명,NS5A단백재AcNS5A중조병독감염세포24h후주요분포재세포질막상,이재48h후칙동시분포우세포질막화세포핵내,재72h칙완전포만정개세포,아문인위NS5A단백정위우질막화세포핵중,암시착재병독복제과정중NS5A단백가능삼여병독RNA재질막상복제화세포기인표체적조공.
