中国医学科学院学报
中國醫學科學院學報
중국의학과학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE
2006年
4期
549-552
,共4页
蔡炯%李方%张迎强%郑连芳%蒲圻
蔡炯%李方%張迎彊%鄭連芳%蒲圻
채형%리방%장영강%정련방%포기
膜联蛋白V%突变%表达%毕赤酵母
膜聯蛋白V%突變%錶達%畢赤酵母
막련단백V%돌변%표체%필적효모
目的 将人膜联蛋白V基因突变后转化入毕赤酵母重组表达,从培养液中纯化出具有内在金属螯合位点的活性突变型人膜联蛋白V.方法应用特异引物将天然人膜联蛋白V基因的5'和3'端进行突变改造,将突变型膜联蛋白V基因插入到pPIC9K质粒并进行基因测序鉴定.将正确连接的表达质粒线性化后用电穿孔法转化到毕赤酵母GS115中.通过MD平板筛选转化子、BMGY培养基培养、甲醇诱导表达目的蛋白质.培养物经过离心获取上清液,用SDS-PAGE和银染分析蛋白质的表达情况,通过外露磷脂酰丝氨酸的红细胞和异硫氰酸荧光素标记膜联蛋白V测定上清液中突变型人膜联蛋白V的结合活性.结果 天然人膜联蛋白V基因5'端融合GCAGGCGGCTGCGGCCAT编码序列,3'端946～948位TGT突变为AGC.毕赤酵母转化子分泌产生相对分子质量为36000的蛋白质,其半数抑制浓度为4nmol/L.结论 利用毕赤酵母系统表达出高活性的、具有内在金属螯合位点的突变型人膜联蛋白V.
目的 將人膜聯蛋白V基因突變後轉化入畢赤酵母重組錶達,從培養液中純化齣具有內在金屬螯閤位點的活性突變型人膜聯蛋白V.方法應用特異引物將天然人膜聯蛋白V基因的5'和3'耑進行突變改造,將突變型膜聯蛋白V基因插入到pPIC9K質粒併進行基因測序鑒定.將正確連接的錶達質粒線性化後用電穿孔法轉化到畢赤酵母GS115中.通過MD平闆篩選轉化子、BMGY培養基培養、甲醇誘導錶達目的蛋白質.培養物經過離心穫取上清液,用SDS-PAGE和銀染分析蛋白質的錶達情況,通過外露燐脂酰絲氨痠的紅細胞和異硫氰痠熒光素標記膜聯蛋白V測定上清液中突變型人膜聯蛋白V的結閤活性.結果 天然人膜聯蛋白V基因5'耑融閤GCAGGCGGCTGCGGCCAT編碼序列,3'耑946～948位TGT突變為AGC.畢赤酵母轉化子分泌產生相對分子質量為36000的蛋白質,其半數抑製濃度為4nmol/L.結論 利用畢赤酵母繫統錶達齣高活性的、具有內在金屬螯閤位點的突變型人膜聯蛋白V.
목적 장인막련단백V기인돌변후전화입필적효모중조표체,종배양액중순화출구유내재금속오합위점적활성돌변형인막련단백V.방법응용특이인물장천연인막련단백V기인적5'화3'단진행돌변개조,장돌변형막련단백V기인삽입도pPIC9K질립병진행기인측서감정.장정학련접적표체질립선성화후용전천공법전화도필적효모GS115중.통과MD평판사선전화자、BMGY배양기배양、갑순유도표체목적단백질.배양물경과리심획취상청액,용SDS-PAGE화은염분석단백질적표체정황,통과외로린지선사안산적홍세포화이류청산형광소표기막련단백V측정상청액중돌변형인막련단백V적결합활성.결과 천연인막련단백V기인5'단융합GCAGGCGGCTGCGGCCAT편마서렬,3'단946～948위TGT돌변위AGC.필적효모전화자분비산생상대분자질량위36000적단백질,기반수억제농도위4nmol/L.결론 이용필적효모계통표체출고활성적、구유내재금속오합위점적돌변형인막련단백V.
