CAJ | 학술논문

本研究旨在构建并制备人硫氧还蛋白(hTRX)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因腺病毒载体Ad-hTRX-EGFP,感染HEK293细胞,为基因治疗提供实验基础.设计含有Not Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切位点的引物,PCR扩增hTRX,将扩增产物连接到带有EGFP标记的pDC316-mCMV穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-hTRX-EG-FP,利用Lipofectamine2000脂质体的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHG lox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-hTRX-EGFP共转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒pAd-hTRX-EGFP,并在其中包装扩增病毒,用氯化铯高速梯度离心、纯化病毒,测定病毒颗粒数及滴度.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,用流式细胞仪测定感染HEK293细胞的效率,Western blot方法验证细胞表达hTRX蛋白.结果显示,重组腺病毒质粒经PCR和Not Ⅰ、EcoR Ⅴ酶切鉴定,证实含有hTRX基因,测序结果和设计片段的序列一致.重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达5.558 × 1010pfu/ml.病毒成功感染HEK293细胞,MOI=100时,感染效率达92.25％.经Western blot方法验证表明,感染后的HEK293细胞高表达hTRX蛋白.结论:应用细胞内同源重组方法成功构建了含hTRX基因的重组腺病毒载体,制备获得高滴度的病毒,能高效感染HEK293细胞并表达目的蛋白,为后续研究奠定了基础.
본연구지재구건병제비인류양환단백(hTRX)화증강형록색형광단백(EGFP)기인선병독재체Ad-hTRX-EGFP,감염HEK293세포,위기인치료제공실험기출.설계함유Not Ⅰ화EcoR Ⅴ매절위점적인물,PCR확증hTRX,장확증산물련접도대유EGFP표기적pDC316-mCMV천사질립상,구건중조천사질립pDC316-hTRX-EG-FP,이용Lipofectamine2000지질체적방법장AdMax선병독포장계통적골가질립pBHG lox_E1,3Cre화천사질립pDC316-hTRX-EGFP공전염입HEK293세포,진행동원중조,득도선병독중조질립pAd-hTRX-EGFP,병재기중포장확증병독,용록화색고속제도리심、순화병독,측정병독과립수급적도.채용PCR방법대중조선병독진행감정,용류식세포의측정감염HEK293세포적효솔,Western blot방법험증세포표체hTRX단백.결과현시,중조선병독질립경PCR화Not Ⅰ、EcoR Ⅴ매절감정,증실함유hTRX기인,측서결과화설계편단적서렬일치.중조선병독재체구건성공,병독적도체5.558 × 1010pfu/ml.병독성공감염HEK293세포,MOI=100시,감염효솔체92.25％.경Western blot방법험증표명,감염후적HEK293세포고표체hTRX단백.결론:응용세포내동원중조방법성공구건료함hTRX기인적중조선병독재체,제비획득고적도적병독,능고효감염HEK293세포병표체목적단백,위후속연구전정료기출.