CAJ | 학술논문

背景:发育生物学研究表明,表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、重建的关键性源泉,如何从皮肤组织中分离获得更多的表皮干细胞,并在体外培养过程中保持干细胞特性足其在皮肤组织工程中应用的重要前提.目的:观察Ⅳ型胶原快速黏附法分选的人胎儿表皮干细胞体外生长状态及克隆形成情况,并与角质细胞进行对照.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在南昌大学第一附属医院烧伤研究所完成.材料:因创伤等原因致意外流产的妊娠24～26周龄胎儿皮肤标本,由南昌大学第一附属医院产科提供.Ⅳ型胶原为美国Sigma公司产品,角质细胞无血清培养基为美国Gibeo公司产品.方法:将Ⅳ型胶原用磷酸盐缓冲液稀释成100 mg/L,均匀涂被培养板后于超净工作台中风干备用.无菌条件下取胎儿皮肤标本,剪成3.0 mm×5.0 mm皮条片,4℃胰蛋白酶+EDTA联合消化8～10 h,表皮真皮分离,用角质细胞无血清培养基将表皮反复吹打,获得单细胞悬液接种于预处理好的Ⅳ型胶原培养板,置37℃、体移J分数为0.05的C02饱和湿度培养箱中,20 min后吸去培养液和未黏附细胞,加入含体积分数为0.1的胎牛血清、10 μ g/L表皮生长因子及角质细胞无血清培养基的表皮十细胞培养液,细胞约70%～80%融合后传代扩增;将未黏附细胞接种于另一培养板中,相同条件下作为角质细胞对照培养.主要观察指标:表皮干细胞的形态变化、免疫细胞化学染色鉴定结果及克隆形成率.结果:经贴壁筛选的表皮干细胞接种后呈圆形,折光性较强:1 d后细胞略伸展为扁平的多角形.胞质近中央处有圆形核:3 d时出现表皮十细胞克隆;5 d时克隆数量明显增多,细胞之间紧密衔接,呈铺路石状:14 d左右细胞基本融合.分离培养的人表皮干细胞克隆β整合素、角蚩白19、p63均呈阳性表达.表皮干细胞克隆形成率明显高于角质细胞克隆形成率(t=1.972,P＜0.05).结论:采用Ⅳ型胶原快速黏附法成功筛选出纯度较高的人胎儿表皮干细胞,且呈明显克隆性生长,具有典型的干细胞生物学特性. 揹景:髮育生物學研究錶明,錶皮榦細胞是皮膚及其附屬器髮生、脩複、重建的關鍵性源泉,如何從皮膚組織中分離穫得更多的錶皮榦細胞,併在體外培養過程中保持榦細胞特性足其在皮膚組織工程中應用的重要前提.目的:觀察Ⅳ型膠原快速黏附法分選的人胎兒錶皮榦細胞體外生長狀態及剋隆形成情況,併與角質細胞進行對照.設計、時間及地點:細胞學體外觀察,于2008-01/06在南昌大學第一附屬醫院燒傷研究所完成.材料:因創傷等原因緻意外流產的妊娠24～26週齡胎兒皮膚標本,由南昌大學第一附屬醫院產科提供.Ⅳ型膠原為美國Sigma公司產品,角質細胞無血清培養基為美國Gibeo公司產品.方法:將Ⅳ型膠原用燐痠鹽緩遲液稀釋成100 mg/L,均勻塗被培養闆後于超淨工作檯中風榦備用.無菌條件下取胎兒皮膚標本,剪成3.0 mm×5.0 mm皮條片,4℃胰蛋白酶+EDTA聯閤消化8～10 h,錶皮真皮分離,用角質細胞無血清培養基將錶皮反複吹打,穫得單細胞懸液接種于預處理好的Ⅳ型膠原培養闆,置37℃、體移J分數為0.05的C02飽和濕度培養箱中,20 min後吸去培養液和未黏附細胞,加入含體積分數為0.1的胎牛血清、10 μ g/L錶皮生長因子及角質細胞無血清培養基的錶皮十細胞培養液,細胞約70%～80%融閤後傳代擴增;將未黏附細胞接種于另一培養闆中,相同條件下作為角質細胞對照培養.主要觀察指標:錶皮榦細胞的形態變化、免疫細胞化學染色鑒定結果及剋隆形成率.結果:經貼壁篩選的錶皮榦細胞接種後呈圓形,摺光性較彊:1 d後細胞略伸展為扁平的多角形.胞質近中央處有圓形覈:3 d時齣現錶皮十細胞剋隆;5 d時剋隆數量明顯增多,細胞之間緊密銜接,呈鋪路石狀:14 d左右細胞基本融閤.分離培養的人錶皮榦細胞剋隆β整閤素、角蚩白19、p63均呈暘性錶達.錶皮榦細胞剋隆形成率明顯高于角質細胞剋隆形成率(t=1.972,P＜0.05).結論:採用Ⅳ型膠原快速黏附法成功篩選齣純度較高的人胎兒錶皮榦細胞,且呈明顯剋隆性生長,具有典型的榦細胞生物學特性.
배경:발육생물학연구표명,표피간세포시피부급기부속기발생、수복、중건적관건성원천,여하종피부조직중분리획득경다적표피간세포,병재체외배양과정중보지간세포특성족기재피부조직공정중응용적중요전제.목적:관찰Ⅳ형효원쾌속점부법분선적인태인표피간세포체외생장상태급극륭형성정황,병여각질세포진행대조.설계、시간급지점:세포학체외관찰,우2008-01/06재남창대학제일부속의원소상연구소완성.재료:인창상등원인치의외유산적임신24～26주령태인피부표본,유남창대학제일부속의원산과제공.Ⅳ형효원위미국Sigma공사산품,각질세포무혈청배양기위미국Gibeo공사산품.방법:장Ⅳ형효원용린산염완충액희석성100 mg/L,균균도피배양판후우초정공작태중풍간비용.무균조건하취태인피부표본,전성3.0 mm×5.0 mm피조편,4℃이단백매+EDTA연합소화8～10 h,표피진피분리,용각질세포무혈청배양기장표피반복취타,획득단세포현액접충우예처리호적Ⅳ형효원배양판,치37℃、체이J분수위0.05적C02포화습도배양상중,20 min후흡거배양액화미점부세포,가입함체적분수위0.1적태우혈청、10 μ g/L표피생장인자급각질세포무혈청배양기적표피십세포배양액,세포약70%～80%융합후전대확증;장미점부세포접충우령일배양판중,상동조건하작위각질세포대조배양.주요관찰지표:표피간세포적형태변화、면역세포화학염색감정결과급극륭형성솔.결과:경첩벽사선적표피간세포접충후정원형,절광성교강:1 d후세포략신전위편평적다각형.포질근중앙처유원형핵:3 d시출현표피십세포극륭;5 d시극륭수량명현증다,세포지간긴밀함접,정포로석상:14 d좌우세포기본융합.분리배양적인표피간세포극륭β정합소、각치백19、p63균정양성표체.표피간세포극륭형성솔명현고우각질세포극륭형성솔(t=1.972,P＜0.05).결론:채용Ⅳ형효원쾌속점부법성공사선출순도교고적인태인표피간세포,차정명현극륭성생장,구유전형적간세포생물학특성.