生物工程学报
生物工程學報
생물공정학보
CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY
2008年
11期
1924-1930
,共7页
蔺增曦%王胜兰%杨秀山%杨克迁
藺增晞%王勝蘭%楊秀山%楊剋遷
린증희%왕성란%양수산%양극천
split Ssp DnaB mini-intein%环肽库%自我剪接
split Ssp DnaB mini-intein%環肽庫%自我剪接
split Ssp DnaB mini-intein%배태고%자아전접
以pET28a为起始质粒,构建高表达DnaB split intein的重组质粒.将质粒pVmut上的编码IntC-dnaB-N-IntN片段克隆至pET28a,得到表达载体pEV,在T7启动子的作用下可使融合DnaB split intein大量表达;并在split intein介导下发生催化DnaB-N的剪接反应,生成环化的DnaB-N蛋白.将合成的包含随机编码5肽的大小为115 bp的片段插入质粒pEV DnaB-N位置,转化大肠杆菌后得到一个编码含有6肽(含5个随机氨基酸和1个Cys)的包含约103个克隆的表达载体pEV-IS库.随机挑取20个克隆,测序证明均按正确阅读框插入了不同的小肽序列;挑取其中9个克隆进行表达.结果表明可产生大量的融合蛋白,90%的融合蛋白在16℃表达20 h后发生体内剪接.将在30℃表达3 h的融合蛋白用His柱进行纯化,通过MALDI-TOF质谱检测到了目的环肽分子量.
以pET28a為起始質粒,構建高錶達DnaB split intein的重組質粒.將質粒pVmut上的編碼IntC-dnaB-N-IntN片段剋隆至pET28a,得到錶達載體pEV,在T7啟動子的作用下可使融閤DnaB split intein大量錶達;併在split intein介導下髮生催化DnaB-N的剪接反應,生成環化的DnaB-N蛋白.將閤成的包含隨機編碼5肽的大小為115 bp的片段插入質粒pEV DnaB-N位置,轉化大腸桿菌後得到一箇編碼含有6肽(含5箇隨機氨基痠和1箇Cys)的包含約103箇剋隆的錶達載體pEV-IS庫.隨機挑取20箇剋隆,測序證明均按正確閱讀框插入瞭不同的小肽序列;挑取其中9箇剋隆進行錶達.結果錶明可產生大量的融閤蛋白,90%的融閤蛋白在16℃錶達20 h後髮生體內剪接.將在30℃錶達3 h的融閤蛋白用His柱進行純化,通過MALDI-TOF質譜檢測到瞭目的環肽分子量.
이pET28a위기시질립,구건고표체DnaB split intein적중조질립.장질립pVmut상적편마IntC-dnaB-N-IntN편단극륭지pET28a,득도표체재체pEV,재T7계동자적작용하가사융합DnaB split intein대량표체;병재split intein개도하발생최화DnaB-N적전접반응,생성배화적DnaB-N단백.장합성적포함수궤편마5태적대소위115 bp적편단삽입질립pEV DnaB-N위치,전화대장간균후득도일개편마함유6태(함5개수궤안기산화1개Cys)적포함약103개극륭적표체재체pEV-IS고.수궤도취20개극륭,측서증명균안정학열독광삽입료불동적소태서렬;도취기중9개극륭진행표체.결과표명가산생대량적융합단백,90%적융합단백재16℃표체20 h후발생체내전접.장재30℃표체3 h적융합단백용His주진행순화,통과MALDI-TOF질보검측도료목적배태분자량.
