农业生物技术学报
農業生物技術學報
농업생물기술학보
JOURNAL OF AGRICULTURAL BIOTECHNOLOGY
2010年
2期
362-367
,共6页
徐荣燕%张亚波%谢晨%张超%李多川
徐榮燕%張亞波%謝晨%張超%李多川
서영연%장아파%사신%장초%리다천
疏绵状嗜热丝孢菌%糖化酶%克隆%毕赤酵母%性质
疏綿狀嗜熱絲孢菌%糖化酶%剋隆%畢赤酵母%性質
소면상기열사포균%당화매%극륭%필적효모%성질
本研究以疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces laltltginosus)cDNA为模板,克隆了糖化酶基因(gla),序列分析表明gla的开放阅读框由1854个核苷酸组成,编码617个氨基酸.根据氨基酸序列推算该酶的分子量为64 kD,属于糖苷水解酶第15家族,具有该家族催化保守区的典型特征.PCR扩增gla的成熟蛋白编码基因,构建表达载体,经线性化后电击转化导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris GS115),并成功进行了表达.重组酶经摇瓶发酵后酶活可达11.6 U/mL,经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换等步骤纯化了该重组蛋白,SDS-PAGE显示该重组蛋白大小约为67kD,比推测的蛋白分子量稍大,可能与该蛋白的糖基化有关.该重组酶的最适反应温度和最适pH值分别为60℃和5.0,该酶具有较高的热稳定性,70℃保温20 min后剩余酶活为54%.
本研究以疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces laltltginosus)cDNA為模闆,剋隆瞭糖化酶基因(gla),序列分析錶明gla的開放閱讀框由1854箇覈苷痠組成,編碼617箇氨基痠.根據氨基痠序列推算該酶的分子量為64 kD,屬于糖苷水解酶第15傢族,具有該傢族催化保守區的典型特徵.PCR擴增gla的成熟蛋白編碼基因,構建錶達載體,經線性化後電擊轉化導入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris GS115),併成功進行瞭錶達.重組酶經搖瓶髮酵後酶活可達11.6 U/mL,經硫痠銨沉澱、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換等步驟純化瞭該重組蛋白,SDS-PAGE顯示該重組蛋白大小約為67kD,比推測的蛋白分子量稍大,可能與該蛋白的糖基化有關.該重組酶的最適反應溫度和最適pH值分彆為60℃和5.0,該酶具有較高的熱穩定性,70℃保溫20 min後剩餘酶活為54%.
본연구이소면상기열사포균(Thermomyces laltltginosus)cDNA위모판,극륭료당화매기인(gla),서렬분석표명gla적개방열독광유1854개핵감산조성,편마617개안기산.근거안기산서렬추산해매적분자량위64 kD,속우당감수해매제15가족,구유해가족최화보수구적전형특정.PCR확증gla적성숙단백편마기인,구건표체재체,경선성화후전격전화도입파사덕필적효모(Pichia pastoris GS115),병성공진행료표체.중조매경요병발효후매활가체11.6 U/mL,경류산안침정、DEAE-Sepharose Fast Flow음리자교환등보취순화료해중조단백,SDS-PAGE현시해중조단백대소약위67kD,비추측적단백분자량초대,가능여해단백적당기화유관.해중조매적최괄반응온도화최괄pH치분별위60℃화5.0,해매구유교고적열은정성,70℃보온20 min후잉여매활위54%.
