中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2011年
40期
7541-7544
,共4页
杨文钢%薛松%连锋%汪永义%黄日太%朱洪生
楊文鋼%薛鬆%連鋒%汪永義%黃日太%硃洪生
양문강%설송%련봉%왕영의%황일태%주홍생
慢病毒载体%Nesprin蛋白%骨髓间充质干细胞%病毒滴度%干扰载体
慢病毒載體%Nesprin蛋白%骨髓間充質榦細胞%病毒滴度%榦擾載體
만병독재체%Nesprin단백%골수간충질간세포%병독적도%간우재체
背景:Nesprin蛋白缺失将影响细胞骨架组织和动态平衡,引起细胞骨架刚性丧失或导致细胞过早成熟老化,其对间充质干细胞的作用如何?目的:构建Nesprin蛋白siRNA慢病毒载体,并转染骨髓间充质干细胞.方法:针对Nesprin靶基因序列设计并合成4对miRNA oligo,将4种miRNA干扰质粒转入大鼠血管平滑肌细胞,筛选最有效干扰序列;将最佳干扰序列和pDONR221载体进行重组反应,获得含干扰序列的入门载体,再将入门载体和慢病毒表达目的载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应,获得含干扰序列的慢病毒表达载体,转染包装细胞293T细胞,包装慢病毒,以293T细胞GFP蛋白水平测定病毒滴度.慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞.结果与结论:测序证实合成的4对miRNA oligo正确,RT-PCR和western-blot筛选出最佳干扰miRNA质粒为SR-3,成功构建了Nesprin siRNA的慢病毒载体LV-siNesprin.包装慢病毒,浓缩病毒悬液的活性滴度为106 TU/mL.慢病毒成功了转染骨髓间充质干细胞细胞.
揹景:Nesprin蛋白缺失將影響細胞骨架組織和動態平衡,引起細胞骨架剛性喪失或導緻細胞過早成熟老化,其對間充質榦細胞的作用如何?目的:構建Nesprin蛋白siRNA慢病毒載體,併轉染骨髓間充質榦細胞.方法:針對Nesprin靶基因序列設計併閤成4對miRNA oligo,將4種miRNA榦擾質粒轉入大鼠血管平滑肌細胞,篩選最有效榦擾序列;將最佳榦擾序列和pDONR221載體進行重組反應,穫得含榦擾序列的入門載體,再將入門載體和慢病毒錶達目的載體pLenti6/V5-DEST進行重組反應,穫得含榦擾序列的慢病毒錶達載體,轉染包裝細胞293T細胞,包裝慢病毒,以293T細胞GFP蛋白水平測定病毒滴度.慢病毒轉染大鼠骨髓間充質榦細胞.結果與結論:測序證實閤成的4對miRNA oligo正確,RT-PCR和western-blot篩選齣最佳榦擾miRNA質粒為SR-3,成功構建瞭Nesprin siRNA的慢病毒載體LV-siNesprin.包裝慢病毒,濃縮病毒懸液的活性滴度為106 TU/mL.慢病毒成功瞭轉染骨髓間充質榦細胞細胞.
배경:Nesprin단백결실장영향세포골가조직화동태평형,인기세포골가강성상실혹도치세포과조성숙노화,기대간충질간세포적작용여하?목적:구건Nesprin단백siRNA만병독재체,병전염골수간충질간세포.방법:침대Nesprin파기인서렬설계병합성4대miRNA oligo,장4충miRNA간우질립전입대서혈관평활기세포,사선최유효간우서렬;장최가간우서렬화pDONR221재체진행중조반응,획득함간우서렬적입문재체,재장입문재체화만병독표체목적재체pLenti6/V5-DEST진행중조반응,획득함간우서렬적만병독표체재체,전염포장세포293T세포,포장만병독,이293T세포GFP단백수평측정병독적도.만병독전염대서골수간충질간세포.결과여결론:측서증실합성적4대miRNA oligo정학,RT-PCR화western-blot사선출최가간우miRNA질립위SR-3,성공구건료Nesprin siRNA적만병독재체LV-siNesprin.포장만병독,농축병독현액적활성적도위106 TU/mL.만병독성공료전염골수간충질간세포세포.
