构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定
구건효질원섬유산성단백원핵표체재체급단백표체감정
Protein identification following construct glial fibillary acidic protein prokaryotic expression vector
  • 万方数据
    中国组织工程研究与临床康复 중국조직공정연구여림상강복
    JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
    2009年 15期 2923-2926 ,共4页

    曹鹏%吕立权%王爽%胡国汉%齐向前%陈怀瑞%骆纯%侯立军%于明琨%卢亦成

    조붕%려립권%왕상%호국한%제향전%진부서%락순%후립군%우명곤%로역성

    胶质原纤维酸性蛋白%质粒%真核表达载体 膠質原纖維痠性蛋白%質粒%真覈錶達載體
    효질원섬유산성단백%질립%진핵표체재체
    背景:胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用.目的:对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定.设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-09/1 1在上海市长征医院神经外科实验室完成.材料:中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存.方法:从人脑胶质瘤组织提取mRNA,采用反转录一聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Westem-blot鉴定.主要观察指标:总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定.结果:抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带.且总RNA的A260nm/A280nm值为1.903.聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致.重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白.结论:用双酶切、DNA测序与Western.blot的方法证实原核表达载体构建成功.
    배경:효질원섬유산성단백재신경손상적발생발전과정중구유중요작용.목적:대효질섬유산성단백진행기인극륭,구건원핵표체질립병가이감정.설계、시간급지점:단일양본관찰,우2008-09/1 1재상해시장정의원신경외과실험실완성.재료:중간재체pGEM-T Easy질립구우Promega공사,원핵표체질립pGEX-4T-2유상해시장정의원신경외과실험실보존.방법:종인뇌효질류조직제취mRNA,채용반전록일취합매련반응적방법확증효질섬유산성단백서렬병표체,연후여재체pGEX-4T-2련접,전화숙주균BL21구건중조질립,유도표체후순화,Westem-blot감정.주요관찰지표:총RNA감정결과,취합매련반응확증산물분자질량적감정,중조표체재체적매절감정,Western-blot감정.결과:추제종류조직총RNA후,전영청석가견rRNA28S、18S、5S 3조대.차총RNA적A260nm/A280nm치위1.903.취합매련반응결과현시,재약1 300 bp좌우유일조특이성조대,여예기적효질원섬유산성단백기인대소일치.중조표체재체적매절감정급측서결과여GenBank적효질원섬유산성단백서렬일치,경Western-blot험증위목적단백.결론:용쌍매절、DNA측서여Western.blot적방법증실원핵표체재체구건성공.
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