中国组织工程研究与临床康复
中國組織工程研究與臨床康複
중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2009年
20期
3947-3951
,共5页
脑源性神经营养因子%腺病毒载体%增强型绿色荧光蚩白%基因重组
腦源性神經營養因子%腺病毒載體%增彊型綠色熒光蚩白%基因重組
뇌원성신경영양인자%선병독재체%증강형록색형광치백%기인중조
背景:基因治疗是目前脊髓损伤治疗的方向,目的基因和载体是基因治疗的关键.目的:构建携带增强型绿色荧光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)标志人脑源性神经营养因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重组腺病毒载体.设计、时间及地点:单.一样本观察,实验于2007-09/2008-06在福建医科大学附属第一医院完成.材料:感受态大肠杆菌DH-5 α购自美国Stratagene公司;pDC316-hBDNF、载体质粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包装系统AdMax 和包装细胞株293购自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF为模板,聚合酶链反应扩增酶切获得hBDNF基因片段,连接到带有EGFP标记基因的载体质粒pDC316-mCMV-EGFP上,构建穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包装系统.穿梭质粒与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染293包装细胞,同源重组产生复制缺陷型重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,反复感染293细胞扩增病毒后,离子交换法纯化病毒,并测定病毒颗粒数及滴度.主要观察指标:①hBDNF基因原始质粒聚合酶链反应鉴定.②穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的构建及鉴定.③重组腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包装、扩增及纯化.④毒种目的基因的聚合酶链反应鉴定.⑤纯化病毒的滴度测定结果.结果:经聚合酶链反应鉴定、限制性酶切分析及序列测定,证明已正确构建重组穿梭质粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP;扩增纯化后,测得重组腺病毒颗粒数为2.4×1011VP/mL,A260/A280值约为2.0,滴度为0.8×1010 CCID50/mL.结论:已成功构建重组腺病毒载体Ad5-hBDNF-EGFP,为hBDNF基因功能及基因治疗的进一步研究奠定实验基础.
揹景:基因治療是目前脊髓損傷治療的方嚮,目的基因和載體是基因治療的關鍵.目的:構建攜帶增彊型綠色熒光蛋白基因(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)標誌人腦源性神經營養因子(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)基因重組腺病毒載體.設計、時間及地點:單.一樣本觀察,實驗于2007-09/2008-06在福建醫科大學附屬第一醫院完成.材料:感受態大腸桿菌DH-5 α購自美國Stratagene公司;pDC316-hBDNF、載體質粒pDC316-mCMV-EGFP、腺病毒骨架質粒pBHGlox_E1,3Cre 、腺病毒包裝繫統AdMax 和包裝細胞株293購自加拿大Mixcrobixg- Biosysrerms公司.方法:以pDC316-hBDNF為模闆,聚閤酶鏈反應擴增酶切穫得hBDNF基因片段,連接到帶有EGFP標記基因的載體質粒pDC316-mCMV-EGFP上,構建穿梭質粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.利用AdMax包裝繫統.穿梭質粒與骨架質粒pBHGlox_E1,3Cre共轉染293包裝細胞,同源重組產生複製缺陷型重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP,反複感染293細胞擴增病毒後,離子交換法純化病毒,併測定病毒顆粒數及滴度.主要觀察指標:①hBDNF基因原始質粒聚閤酶鏈反應鑒定.②穿梭質粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP的構建及鑒定.③重組腺病毒Ad5-hBDNF-EGFP的包裝、擴增及純化.④毒種目的基因的聚閤酶鏈反應鑒定.⑤純化病毒的滴度測定結果.結果:經聚閤酶鏈反應鑒定、限製性酶切分析及序列測定,證明已正確構建重組穿梭質粒pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP和重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP;擴增純化後,測得重組腺病毒顆粒數為2.4×1011VP/mL,A260/A280值約為2.0,滴度為0.8×1010 CCID50/mL.結論:已成功構建重組腺病毒載體Ad5-hBDNF-EGFP,為hBDNF基因功能及基因治療的進一步研究奠定實驗基礎.
배경:기인치료시목전척수손상치료적방향,목적기인화재체시기인치료적관건.목적:구건휴대증강형록색형광단백기인(Enhanced green fluorescence protein,EGFP)표지인뇌원성신경영양인자(human brai-denved neurotrophic factor,hBDNF)기인중조선병독재체.설계、시간급지점:단.일양본관찰,실험우2007-09/2008-06재복건의과대학부속제일의원완성.재료:감수태대장간균DH-5 α구자미국Stratagene공사;pDC316-hBDNF、재체질립pDC316-mCMV-EGFP、선병독골가질립pBHGlox_E1,3Cre 、선병독포장계통AdMax 화포장세포주293구자가나대Mixcrobixg- Biosysrerms공사.방법:이pDC316-hBDNF위모판,취합매련반응확증매절획득hBDNF기인편단,련접도대유EGFP표기기인적재체질립pDC316-mCMV-EGFP상,구건천사질립pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP.이용AdMax포장계통.천사질립여골가질립pBHGlox_E1,3Cre공전염293포장세포,동원중조산생복제결함형중조선병독재체Ad5-hBDNF-EGFP,반복감염293세포확증병독후,리자교환법순화병독,병측정병독과립수급적도.주요관찰지표:①hBDNF기인원시질립취합매련반응감정.②천사질립pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP적구건급감정.③중조선병독Ad5-hBDNF-EGFP적포장、확증급순화.④독충목적기인적취합매련반응감정.⑤순화병독적적도측정결과.결과:경취합매련반응감정、한제성매절분석급서렬측정,증명이정학구건중조천사질립pDC316-hBDNF-mCMV-EGFP화중조선병독재체Ad5-hBDNF-EGFP;확증순화후,측득중조선병독과립수위2.4×1011VP/mL,A260/A280치약위2.0,적도위0.8×1010 CCID50/mL.결론:이성공구건중조선병독재체Ad5-hBDNF-EGFP,위hBDNF기인공능급기인치료적진일보연구전정실험기출.
