中国兽医学报
中國獸醫學報
중국수의학보
CHINESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE
2009年
5期
632-636
,共5页
艾永兴%肖昌%郝军元%胡薇%潘风光%郑梅竹%张玉静
艾永興%肖昌%郝軍元%鬍薇%潘風光%鄭梅竹%張玉靜
애영흥%초창%학군원%호미%반풍광%정매죽%장옥정
p15%AP%f9昆虫细胞%状病毒
p15%AP%f9昆蟲細胞%狀病毒
p15%AP%f9곤충세포%상병독
为探讨鸡p15蛋白的特性及其在细胞周期抑制通路中与其他蛋白的作用,本研究选用昆虫细胞表达系统来表达有活性的p15蛋白.为后期纯化的需要,对pFAST供体质粒的多克隆位点进行了重新改造,并成功构建带有TAP纯化标签的供体质粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15.将2个供体质粒转化到DH10Bac感受态菌中,对阳性转化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15进行反复涂板的去阴性单克隆纯化,提取大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15并进行转座鉴定.将纯化的大质粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15转染入sf9昆虫细胞中,72 h后收集培养上清中的杆状病毒,并进行病毒的扩增和滴度测定,结果所获2株重组杆状病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分别为3.6×107,5.4×107pfu/mL.将2株高滴度的重组杆状病毒再感染新培养的sf9昆虫细胞进行重组p15蛋白的表达,结果与对照组相比,重组p15融合蛋白得到了有效的表达,表达量分别为4.32%和4.7%.Western blotting结果表明,所表达的重组p15融合蛋白只特异地与p15单克隆抗体和兔的IgG反应而未与其他细胞蛋白反应;明带有TAP标签的重组p15融合蛋白在昆虫细胞表达系统中得到了有效表达.
為探討鷄p15蛋白的特性及其在細胞週期抑製通路中與其他蛋白的作用,本研究選用昆蟲細胞錶達繫統來錶達有活性的p15蛋白.為後期純化的需要,對pFAST供體質粒的多剋隆位點進行瞭重新改造,併成功構建帶有TAP純化標籤的供體質粒pFAST-NMCS-N-TAP-p15和pFAST-NMCS-C-TAP-p15.將2箇供體質粒轉化到DH10Bac感受態菌中,對暘性轉化子Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15進行反複塗闆的去陰性單剋隆純化,提取大質粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15併進行轉座鑒定.將純化的大質粒Bacmid-N-TAP-p15和Bacmid-C-TAP-p15轉染入sf9昆蟲細胞中,72 h後收集培養上清中的桿狀病毒,併進行病毒的擴增和滴度測定,結果所穫2株重組桿狀病毒N-TAP-p15和C-TAP-p15的滴度分彆為3.6×107,5.4×107pfu/mL.將2株高滴度的重組桿狀病毒再感染新培養的sf9昆蟲細胞進行重組p15蛋白的錶達,結果與對照組相比,重組p15融閤蛋白得到瞭有效的錶達,錶達量分彆為4.32%和4.7%.Western blotting結果錶明,所錶達的重組p15融閤蛋白隻特異地與p15單剋隆抗體和兔的IgG反應而未與其他細胞蛋白反應;明帶有TAP標籤的重組p15融閤蛋白在昆蟲細胞錶達繫統中得到瞭有效錶達.
위탐토계p15단백적특성급기재세포주기억제통로중여기타단백적작용,본연구선용곤충세포표체계통래표체유활성적p15단백.위후기순화적수요,대pFAST공체질립적다극륭위점진행료중신개조,병성공구건대유TAP순화표첨적공체질립pFAST-NMCS-N-TAP-p15화pFAST-NMCS-C-TAP-p15.장2개공체질립전화도DH10Bac감수태균중,대양성전화자Bacmid-N-TAP-p15화Bacmid-C-TAP-p15진행반복도판적거음성단극륭순화,제취대질립Bacmid-N-TAP-p15화Bacmid-C-TAP-p15병진행전좌감정.장순화적대질립Bacmid-N-TAP-p15화Bacmid-C-TAP-p15전염입sf9곤충세포중,72 h후수집배양상청중적간상병독,병진행병독적확증화적도측정,결과소획2주중조간상병독N-TAP-p15화C-TAP-p15적적도분별위3.6×107,5.4×107pfu/mL.장2주고적도적중조간상병독재감염신배양적sf9곤충세포진행중조p15단백적표체,결과여대조조상비,중조p15융합단백득도료유효적표체,표체량분별위4.32%화4.7%.Western blotting결과표명,소표체적중조p15융합단백지특이지여p15단극륭항체화토적IgG반응이미여기타세포단백반응;명대유TAP표첨적중조p15융합단백재곤충세포표체계통중득도료유효표체.
