中国畜牧兽医
中國畜牧獸醫
중국축목수의
CHINA ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
2012年
10期
145-149
,共5页
杨春%朱洪伟%刘宗岳%王桂武%杨福合%邢秀梅
楊春%硃洪偉%劉宗嶽%王桂武%楊福閤%邢秀梅
양춘%주홍위%류종악%왕계무%양복합%형수매
Cre重组酶%肝脏特异性启动子%真核表达载体%三重融合PCR%细胞转染
Cre重組酶%肝髒特異性啟動子%真覈錶達載體%三重融閤PCR%細胞轉染
Cre중조매%간장특이성계동자%진핵표체재체%삼중융합PCR%세포전염
试验旨在建立肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞系,为获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础.通过PCR方法分别从血液和pcDNA3.1(+)载体上扩增肝脏特异性启动子α1-抗胰蛋白酶启动子(PhAAT)和BGHpolyA片段.通过双酶切( XhoⅠ、Sal Ⅰ)从载体pGC-FRT2neo上获得FRT2neo交换盒,再利用重叠PCR方法获得猪源的Cre重组酶基因,最后通过三重融合PCR方法和酶切方法将4个片段连接.利用真核表达载体pC1-neo构建出Cre表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo.LipofectamineTM 2000介导转染猪成纤维细胞,通过G418筛选出阳性细胞系,最后通过PCR鉴定证明构建的Cre重组酶表达载体pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo成功整合到细胞的基因组中,获得了肝脏特异性表达Cre重组酶猪成纤维细胞,为最终通过核移植方法获得肝脏特异性表达Cre重组酶转基因猪奠定基础.
試驗旨在建立肝髒特異性錶達Cre重組酶豬成纖維細胞繫,為穫得肝髒特異性錶達Cre重組酶轉基因豬奠定基礎.通過PCR方法分彆從血液和pcDNA3.1(+)載體上擴增肝髒特異性啟動子α1-抗胰蛋白酶啟動子(PhAAT)和BGHpolyA片段.通過雙酶切( XhoⅠ、Sal Ⅰ)從載體pGC-FRT2neo上穫得FRT2neo交換盒,再利用重疊PCR方法穫得豬源的Cre重組酶基因,最後通過三重融閤PCR方法和酶切方法將4箇片段連接.利用真覈錶達載體pC1-neo構建齣Cre錶達載體pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo.LipofectamineTM 2000介導轉染豬成纖維細胞,通過G418篩選齣暘性細胞繫,最後通過PCR鑒定證明構建的Cre重組酶錶達載體pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo成功整閤到細胞的基因組中,穫得瞭肝髒特異性錶達Cre重組酶豬成纖維細胞,為最終通過覈移植方法穫得肝髒特異性錶達Cre重組酶轉基因豬奠定基礎.
시험지재건립간장특이성표체Cre중조매저성섬유세포계,위획득간장특이성표체Cre중조매전기인저전정기출.통과PCR방법분별종혈액화pcDNA3.1(+)재체상확증간장특이성계동자α1-항이단백매계동자(PhAAT)화BGHpolyA편단.통과쌍매절( XhoⅠ、Sal Ⅰ)종재체pGC-FRT2neo상획득FRT2neo교환합,재이용중첩PCR방법획득저원적Cre중조매기인,최후통과삼중융합PCR방법화매절방법장4개편단련접.이용진핵표체재체pC1-neo구건출Cre표체재체pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo.LipofectamineTM 2000개도전염저성섬유세포,통과G418사선출양성세포계,최후통과PCR감정증명구건적Cre중조매표체재체pC1-PhAATCreBGHpolyA-FRT2neo성공정합도세포적기인조중,획득료간장특이성표체Cre중조매저성섬유세포,위최종통과핵이식방법획득간장특이성표체Cre중조매전기인저전정기출.
